【摘 要】
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目的:本研究通过建立慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型,探讨针刺是否能抑制由外泌体介导的NLRP3炎性小体产物的释放,从而改善肺部炎症和慢性损伤。旨在阐释针灸改善COPD的部分生物学机制,为COPD治疗提供新的思路和途径。方法:将所有小鼠分为六组,包括对照组,模型组,对照+ASM-/-组（Acid Sphingomyelinase,酸性鞘磷脂酶）,模型+ASM-/-组,对照+电针组,模型+电针组
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目的:本研究通过建立慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型,探讨针刺是否能抑制由外泌体介导的NLRP3炎性小体产物的释放,从而改善肺部炎症和慢性损伤。旨在阐释针灸改善COPD的部分生物学机制,为COPD治疗提供新的思路和途径。方法:将所有小鼠分为六组,包括对照组,模型组,对照+ASM-/-组（Acid Sphingomyelinase,酸性鞘磷脂酶）,模型+ASM-/-组,对照+电针组,模型+电针组。通过气管滴注猪胰弹性蛋白酶（PPE）建立了 COPD模型。电针（EA）（4Hz/20Hz,1-3mA）施加于双侧肺俞（BL13）和足三里（ST36）每次30分钟,隔天一次,持续2周。H.E.染色显示肺组织的病理学改变。用免疫组织化学法检测白介素1β（IL-1β）、外泌体标记物（CD63,Annexin Ⅱ）在肺中的分布和表达,用免疫荧光共定位检测肺部组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）、上皮细胞粘附分子（EpCAM）和IL-1β等蛋白的表达,用纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中外泌体（Exosome）的含量。所有值均表示为均值±标准误（x±S.E.）。应用Sigma Plot软件进行统计学分析,所有数据进行处理时均精确至小数点后两位。实验一中若数据符合参数检验标准,组间比较、组内比较采用独立样本T检验;若不符合参数检验标准,组间比较、组内比较采用独立样本秩和检验。实验二和三中多组数据进行正态性检验,各组资料方差齐用单因素方差分析,事后检验采用LSD法;若方差不齐,用非参数检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1、在小鼠为期28天的猪胰弹性蛋白酶（PPE）给药造模结束后,与对照组小鼠相比,模型组小鼠表现出严重的炎症反应,如炎症细胞增多,肺泡囊和间隙增大,肺泡壁增厚（P<0.05）。模型组小鼠中NLRP3与ASC或caspase-1的共定位表达在支气管和肺泡壁里均显示上升（P<0.05）,IL-1β、CD63和AnnexinII的表达也明显增加（P<0.05）,且模型组中IL-1β与CD63共定位表达也明显高于对照组（P<0.05）。另外,模型组小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中含有IL-1β的外泌体显著增加（P<0.05）。2、溶酶体酸鞘磷脂酶基因敲除（ASM-/-）后,再进行PPE滴注造模,发现ASM基因缺失显着减弱了这些炎性体分子（即NLRP3与ASC或caspase-1）的共定位。并且在模型+ASM-/-组小鼠中,IL-1β的表达几乎被完全抑制（P<0.05）。与模型组小鼠相比,模型+ASM-/-组小鼠的支气管和肺泡壁中CD63和Annexin Ⅱ（膜联蛋白2）的表达水平要低得多（P<0.05）。NTA分析也表明,在PPE处理的ASM-/-小鼠中,肺泡灌洗中检测到的外泌体显著降低。3、电针处理后,与模型组相比,电针组肺中NLRP3与ASC或Caspase-1的共定位降低（P<0.05）。电针干预对IL-1β、CD63和Annexin Ⅱ的表达有明显抑制作用。同时,模型+电针组释放到肺泡灌洗液中的外泌体数量也明显少于模型组（P<0.05）。结论:1.NLRP3炎性小体激活和相关的炎性外泌体释放与COPD期间炎症的发展密切相关。酸性鞘磷脂酶在调节NLRP3炎性小体激活和外泌体排泄中起着重要作用,其缺乏抑制炎性小体激活和外泌体释放,从而减轻了肺损伤。2.针灸可通过抑制NLRP3炎性小体的形成和激活,进而减少炎症因子IL-1β的产生,并抑制炎症性外泌体的释放,从而改善COPD期间的肺部炎症和慢性损伤。
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