成熟卵母细胞冻存是女性生育力储存目前最成熟并具有前景的技术,在辅助生殖技术领域有其不可替代的优势,并为人类配子及胚胎发育潜能研究扩展了研究领域。卵母细胞由于其自身特殊的结构特点,在冷冻复苏过程中更易受到损伤,细胞骨架、纺锤体、膜结构和透明带的损伤都影响其复苏后受精与胚胎发育的潜能。卵母细胞冷冻技术诞生后十余年间一直进展缓慢,玻璃化技术的成熟与卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)技术与的应用使其在近十年有了较快发展,目前有了越来越多的应用。但因其安全性仍需更多临床大样本和更多基础研究的论证,卵母细胞冷冻技术目前仍未成为临床的常规操作。卵母细胞冷冻效率的提高和安全性的评估亟需开展,以期更安全、高效地用于临床。玻璃化冷冻基本原理是通过增加温度传导的速度和冷冻保护剂的浓度,使细胞内外液由液态转化为类似玻璃状的非晶体化固体状态,形成透明的玻璃状固体,保留细胞内液体正常的分子和离子分布。玻璃化冷冻技术目前已被证实较慢速冷冻对于卵母细胞冻存有更高的效率,但是冷冻保护剂所需的高浓度可能给细胞带来毒性,冷冻成功的关键在于足够高的降温速率和不至于给细胞造成毒性的冷冻保护剂浓度。本研究通过观察人卵母细胞玻璃化冷冻-复苏前后的形态测量指标、透明带的消化时间、ROS水平、纺锤体结构与H1FOO表达变化研究玻璃化冷冻-复苏过程对卵母细胞在形态学、细胞学和分子学水平的影响,进而比较新鲜和冻融后人体外成熟的卵母细胞体外受精和胚胎发育潜能,并对冻融卵母细胞发育的囊胚进行基因组的测序(CNV-seq)以验证该技术在基因组水平的稳定性和安全性,最后我们进一步分析玻璃化冷冻技术应用于临床人卵母细胞冷冻的数据,并对出生子代家庭进行微阵列芯片比较基因组杂交(a-CGH)检测,以期对人卵母细胞玻璃化冻存的安全性和效率有多方面、深入研究,为该技术的完善和临床应用提供理论基础。第一部分玻璃化冷冻对卵母细胞的影响及机制研究目的:探索玻璃化冷冻技术对人卵母细胞结构和功能的影响。方法:收集常规体外受精周期中人未受精卵母细胞,在玻璃化冷冻前后分别测量其形态学指标,包括平均直径、卵周隙大小、透明带厚度和记录极体完整情况,比较冷冻前后的形态学指标的变化;将未受精卵母细胞分为新鲜组和冷冻组,比较两组透明带用台式液消化所需的时间、胞浆ROS水平和H1FOO表达强度,收集常规体外受精周期获得的未成熟卵母细胞成熟培养后得到成熟卵母细胞,用纺锤体观测仪观察卵母细胞纺锤体,按纺锤体影像分为A、B、C三类,比较冷冻前后纺锤体形态变化,并进一步对部分冷冻后的卵母细胞进行纺锤体的荧光免疫染色,激光共聚焦显微镜观察其结构。结果:(1)共测量未受精MII卵母细胞236枚,玻璃化冷冻-复苏后存活201枚,复苏率85.17%(201/236),复苏后0小时卵母细胞直径(OD)和透明带间隙(PS)均有显著性差异(P<0.05),透明带厚度(ZP)和第一极体完整率没有明显差异,复苏后2小时所有卵母细胞形态学测量数据和冷冻前均没有明显差异。(2)共消化冷冻前卵母细胞50枚,冷冻复苏2小时后卵母细胞50枚,冷冻复苏后的卵母细胞透明带消化时间显著高于未冷冻卵母细胞(P<0.05)。(3)卵母细胞ROS水平共检测未受精卵188枚,其中未冷冻卵母细胞42枚,冷冻复苏后0h卵母细胞49枚,与冷冻前卵母细胞相比ROS水平明显降低,冷冻复苏后2h卵母细胞51枚,ROS水平明显高于冷冻前卵母细胞,冷冻复苏后4h卵母细胞46枚,与冷冻前卵母细胞相比ROS水平略高,但统计学上没有明显差异。(4)H1FOO表达检测共检测未受精卵母细胞104枚,均检测到H1FOO表达,其中冷冻前卵母细胞50枚,冷冻复苏后2h卵母细胞54枚,冷冻后卵母细胞的H1FOO表达较冷冻前表达明显减弱(P<0.05)。(5)共用纺锤体观测仪观察IVM后获得的MII期卵母细胞230枚,玻璃化冷冻复苏后共有195枚卵母细胞存活,不同纺锤体类型的卵母细胞复苏率有显著差异(P<0.05),冷冻前后A类卵母细胞所占比例无明显差异。(6)共检测IVM后的新鲜MII卵母细胞16枚,异常纺锤体2枚,冷冻复苏后卵母细胞30枚,异常4枚,异常率占13.3%(4/30),玻璃化冷冻对纺锤体结构无影响。结论:玻璃化冷冻技术对卵母细胞的透明带、复苏后2h ROS水平和H1FOO表达均有影响,对复苏后2h卵母细胞形态学指标和纺锤体无影响。第二部分玻璃化冷冻后卵母细胞发育潜能与囊胚CNV-seq测序目的:比较人卵母细胞冷冻前后卵母细胞发育潜能,在基因组水平对冷冻-复苏卵母细胞发育的囊胚进行安全性检测。方法:收集常规体外受精周期中未成熟卵母细胞,进行体外成熟培养后获得成熟卵母细胞,随机分为新鲜组和冷冻组,进行卵母细胞浆内单精子注射授精和胚胎培养,比较两组卵母细胞受精率、卵裂率和胚胎发育情况。并对冷冻组获得的囊胚进行基因组测序(CNV-SEQ),同时我们对未冷冻卵母细胞发育的囊胚进行CNV-SEQ测序作为参照。结果:共获得IVM后MII卵母细胞313枚,其中106枚未经过玻璃化冷冻-复苏程序直接进行卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)授精与胚胎培养,207枚进行玻璃化冷冻复苏,存活175枚,存活率84.54%,两组受精率卵裂率均没有统计学差异,胚胎可用率和囊胚获得率冷冻组明显低于新鲜组(P<0.05),D3胚胎中卵裂球多于5细胞的胚胎数目冷冻组明显少于新鲜组(P<0.05),而两组碎片≥50%的胚胎所占比率无差异。对冷冻组获得的囊胚CNV-SEQ结果显示:8枚检测成功的囊胚中只有1枚胚胎为异常胚胎,异常率12.5%。而对未冷冻卵母细胞受精后发育的囊胚,5枚检测成功的囊胚中有2枚异常,异常率为40%。结论:玻璃化冷冻技术不影响卵母细胞的受精能力,但是影响胚胎的发育潜能,表现在发育速度减慢。对于发育到囊胚的胚胎,基因测序的结果表明在基因组层面是稳定安全的。第三部分玻璃化冻存卵母细胞的临床应用及子代安全性的研究目的:研究统计玻璃化冷冻-复苏技术在临床实施的数据,并在基因组水平检测卵母细胞冷冻出生子代的安全性。方法:统计本中心2011至2013年间卵母细胞冷冻与复苏周期临床数据,并对出生卵母细胞冷冻子代的两个家庭进行全血微阵列芯片比较基因组杂交(a-CGH)检测出生子代安全性。结果:共实施卵母细胞冷冻82周期,其中取卵日无精子可用55周期,部分卵母细胞冻存23周期,生育力保存4周期,共冷冻MII期卵母细胞623枚,平均每周期冷冻7.6枚。共实施玻璃化冷冻卵母细胞复苏45周期,共复苏卵母细胞338枚,存活率84.19%,受精率81.23%,卵裂率92.44%,D3胚胎可用率39.54%,共移植28周期,妊娠7周期,妊娠率25%。其中取卵日无精子可用组与部分冻存卵母细胞组比较,年龄明显偏高(P<0.05),胚胎可用率明显偏低(P<0.05),由于例数较小,妊娠率没有统计学差异(19.05%vs.42.86%,P>0.05)。≤35岁组的每周期复苏卵母细胞数与有可用胚胎周期的比率明显高于大于35岁组,同样由于例数较少,妊娠率没有统计学上的差异(27.27%vs.16.67%)。对于两个家庭的父母和子代a-CGH分析显示,卵母细胞冷冻复苏后出生的子代并未出现新的基因变异。结论:卵母细胞玻璃化冷冻保存对于取卵日无精子可用和获卵数较多的患者是有临床实施价值的,年龄大于35岁的患者卵母细胞冷冻效率下降。卵母细胞子代基因组检测未见异常。