细菌光敏色素(Bacteriophytochrome,简称BphP)是一类在细菌中广泛存在,含有胆绿素分子(Biliverdin,简称BV),对红光或者远红光具有响应的色素-蛋白复合物。尽管BphP天然的生物学功能是光依赖的信号传导,但是经过蛋白质工程技术改造以后可以使这类色素蛋白复合物在近红外区域发射荧光,从而能够作为一种遗传学编码的近红外荧光探针运用于活体成像领域。本论文选择了一类基于根癌农杆菌细菌光敏色素(简称Agp2)改造获得的近红外荧光蛋白PAiRFP1(photoactivatable near-infrared fluorescent protein)作为研究对象。不同于其它的BphP-based改造得到的荧光蛋白,由于PAiRFP1含有PHY区域,所以它具有光激活行为,即在光照后伴随着Pfr态(far red-light absorbing state)向Pr态(red-light absorbing state)转换,其近红外荧光强度增加,这个特点使得它在肿瘤活体成像时可以提高信噪比,但到目前为止哪些因素会影响光激活行为鲜见报道。围绕这个问题,本论文借助PCR定点突变、蛋白质工程并结合光谱学手段研究了各种环境因素(包括pH,金属离子、氧化还原条件、温度)以及BV结合口袋附近氨基酸残基性质对于光激活行为的影响,发现(1)在各种外界环境因素中,对于光激活行为影响最为显著的是环境的pH和近红外荧光蛋白所处的温度。在一定范围内随着pH升高,光激活效率提高,速率有所下降。随着温度升高,光激活出现了非均一的变化状态。(2)BV结合口袋附近氨基酸残基对于光激活行为的影响各有不同,具体如下:(1)对于V276G、P459A和C249S等突变体,它们仍然具有光激活行为,但是光激活效率和速率都与野生型相比有所不同。(2)当Cys-13分别被突变成丝氨酸、精氨酸之后,伴随着Pfr态的消失,光激活现象不存在;类似现象在Asp-196和His-248突变体中也观察到;对于距离BV稍远的IIe-20残基,我们也开展了类似实验,观察到类似现象。此外,本论文还初步探讨了影响近红外荧光蛋白光激活行为的原因,主要涉及到pK_a的检测、光激活动力学、活化能以及盐酸胍变性等实验,相关工作为以后深入研究各类氨基酸残基对于光激活蛋白影响作用的机理奠定了一定的基础。