在全球气候变暖大背景下,气温不断升高并伴随着频繁的高温天气。我国是设施面积最大的国家,半封闭的设施环境内更容易形成高温环境。番茄是我国极为重要的园艺作物和设施主栽培作物,高温胁迫严重危害了我国番茄的品质和制约了番茄产业的高效周年生产。因此探索高温胁迫下番茄内在的调控机制,挖掘植物响应高温的分子机制,从而基于植物的高温性状来创新抗性技术,对我国蔬菜产业健康稳定的发展具有十分重要的意义。Ca2+作为一种普遍存在的第二信使调节着植物的胁迫信号机制,在植物响应高温胁迫中发挥重要作用。钙依赖性蛋白激酶CPK是一种重要的钙传感蛋白,可以传递钙信号,并将其转化为下游蛋白质磷酸化事件。近年来,越来越多的研究证实CPK在非生物逆境中发挥的作用,然而CPK在植物高温抗性中的作用及其分子调控机制尚不明确。本文以番茄为研究材料,利用植物生理学、遗传学、分子生物学等技术手段,研究了CPK28在番茄响应高温胁迫中发挥的作用并明确了CPK28突变对植物抗氧化系统的影响,进一步阐明了CPK28通过磷酸化APX2的Thr-59和Thr-164位点调控植物高温抗性的内在分子机制。所得主要结果如下:1、明确了CPK28在番茄响应高温胁迫中的正调控作用。我们利用CRISPR-Cas9技术构建了CPK28基因功能缺失突变体cpk28#36和cpk28#44,发现cpk28高温抗性显著降低,表现为高温处理后更加萎蔫的叶片,叶片电解质渗透率升高,膜脂质过氧化物MDA的含量上升。2、发现了CPK28增强番茄植株高温响应中的抗氧化能力。高温处理能够导致叶片中氧化物质积累蛋白氧化等多种氧化胁迫,使得多种抗氧化酶的活性被激活。我们发现了cpk28突变体细胞内氧化物质O2.-、H2O2的积累量显著增多,ROS清除蛋白2-CP单体含量显著减少,同时APX表达量减少,CAT、APX、DHAR、GR等抗氧化酶活性被抑制,且GSH/GSSG及As A/DHA的比率显著降低。其次我们发现常温条件下cpk28中APX活性和As A/DHA比值也受到抑制,我们通过外源As A处理有效提高了cpk28的高温抗性,提高了高温下As A/DHA的比值。这些结果表明,CPK28通过影响抗氧化酶活性和As A/DHA的水平来参与对植物氧化还原系统的调控,进而影响高温胁迫下植物氧化物质的积累和蛋白质的变性。3、鉴定到CPK28互作靶蛋白APX2并明确其同样正调控番茄高温抗性。通过荧光素酶互补试验和免疫共沉淀Co-IP试验发现CPK28与APX2存在互作,并发现Ca2+诱导CPK28与APX2的互作增强,而钙离子螯合剂EGTA则抑制了CPK28与APX2的互作。进一步,我们构建了apx2,发现APX2同样正调控番茄高温抗性,apx2在高温胁迫下高温抗性降低,光化学效率降低,同时APX活性降低。4、明确了CPK28通过磷酸化APX2的Thr-59和Thr-169影响了APX的活性和植物的高温抗性。CPK28作为蛋白激酶可以磷酸化APX2并激活APX2的活性,且磷酸化受到Ca2+的正向调控。其中APX2的Thr-59和Thr-164残基被CPK28磷酸化,失活型磷酸化位点突变阻断了CPK28的磷酸化,在烟草和番茄中,失活型磷酸化位点不仅削弱了植株的高温抗性,同时降低了APX的活性。以上结果表明,Ca2+介导了CPK28磷酸化APX2,CPK28可能通过磷酸化APX2两个Thr-59和Thr-164残基位点来调控APX2的活性,进而参与调控番茄的氧化还原稳态,提高番茄的高温抗性。