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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)可感染不同年龄段的猪,以种猪繁殖障碍、育肥猪生长缓慢、哺乳仔猪高死亡率为特征。过去30年来,以Bartha-K61为代表的基因缺失疫苗株在我国广泛使用,伪狂犬病已得到有效控制。然而自2011年以来,Bartha-K61疫苗免疫猪群频繁暴发伪狂犬病,给养猪业造成巨大经济损失。研究证明导致免疫猪群发病的是一种变异的PRV,此病毒的致病力比经典的PRV更强,以Bartha-K61为代表的经典伪狂犬病毒基因缺失疫苗不能针对变异的PRV为猪群提供完全免疫保护。全病毒基因组比较分析发现变异的PRV与经典的PRV相比已形成一个独立的遗传进化分支,糖蛋白B(Glycoprotein B,gB)是PRV最主要的保护性抗原,因此推测gB基因的变异可能是导致经典的伪狂犬病疫苗不能完全保护变异PRV的主要原因。为此,本实验将变异PRV的gB基因和Bartha-K61的gB基因互换以探讨gB基因在变异PRV免疫保护中的作用,为进一步开发针对变异PRV的新型疫苗奠定基础。变异PRV流行毒株与疫苗毒株Bartha-K61的主要保护性抗原蛋白进行生物信息学分析发现,PRV变异株的主要保护性抗原存在不同程度的变异。其中,gB基因进化树里PRV变异毒株聚集在一起形成独立分支,与国外经典毒株以及国内早期流行毒株均相距较远,并且在gB抗原表位区域PRV变异株JS-2012与Bartha-K61存在多处氨基酸缺失和替换。这表明PRV变异毒株的gB蛋白极有可能发生了抗原变异。gB基因互换重组PRV的构建。以经典伪狂犬病疫苗Bartha-K61和本实验室构建的变异PRV基因缺失病毒JS-2012-ΔgE/gI为基础,使用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合同源重组互换两者的gB基因,不经过标记基因的插入删除,成功拯救并筛选到重组病毒BJB(Bartha-K61-JS-2012gB)和JBJ(JS-2012-ΔgE/gI-Bartha-K61gB)。重组病毒与亲本毒在体外生物学分析中具有相似的生长特性,且小鼠致病性没有显著差异。这表明成功获得gB替换的重组病毒,为PRV变异毒株gB抗原变异评价分析提供了平台。gB基因互换的重组PRV能够显著改变彼此的免疫原性。将构建的gB互换的重组毒株以及亲本毒株分别制备灭活病毒,免疫小鼠后用变异的PRV JS-2012株进行攻毒试验。结果发现与其亲本毒株Bartha-K61比较,更换了gB基因的重组Bartha-K61(BJB)的免疫保护效率显著提高;相反,与亲本毒株JS-2012-ΔgE/gI比较,更换gB基因的重组JS-2012-ΔgE/gI(JBJ)的免疫保护效率显著下降。这表明gB蛋白是PRV主要保护性抗原,g B基因变异能够显著影响PRV的免疫原性,进一步说明gB基因变异是现有疫苗Bartha-K61不能完全保护猪免于变异PRV攻击的主要原因。糖蛋白C(Glycoprotein C,gC)基因互换重组PRV的构建。生物信息学分析结果显示PRV变异株的保护性抗原gC也与经典PRV差异较大,为探究其抗原变异对PRV交叉免疫保护的影响,在gB互换的基础上,使用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合同源重组对gC基因进一步替换,成功构建并筛选到gC和gB双互换的重组病毒BJbcB(含JS-2012 g B和gC基因的重组Bartha-K61)以及gC基因互换的重组病毒JBcJ(含Bartha-K61 gC基因的重组JS-2012-ΔgE/gI)和Bar-Jc(含有JS-2012-gC的Bartha-K61),为下一步研究gC蛋白在保护性免疫中的作用奠定了基础。综上所述,本研究为PRV变异毒株抗原变异分子基础提供了理论基础,证实了gB变异能够导致Bartha-K61和JS-2012-ΔgE/gI抗原性显著变化,且说明了gB变异在Bartha-K61免疫不完全保护现象中发挥了重要作用。同时,本研究提供了一种高效的基因编辑策略以及重组病毒筛选方法,扩宽了CRISPR/Cas9在DNA病毒基因编辑中的应用,并提供了一种新型伪狂犬病病毒基因工程重组疫苗株的开发策略,成功获得重组病毒BJB可作为新型PRV基因工程疫苗候选株。