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背景：在慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)的自然病程以及临床干预后的病程中，CML细胞对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的耐药始终是一个亟待解决的重要问题。关注于CML特异靶点BCR-ABL1融合蛋白的靶向药物的升级不能解决BCR-ABL1非依赖性耐药，因此，拓展对CML耐药的认识并寻找新的治疗策略与靶点势在必行。转录因子7(transcription factor 7, TCF7)是TCF/LEF家族成员之一，位于Wnt/β-catenin信号的下游发挥作用，已有研究表明TCF7可以赋予结直肠肿瘤干细胞的肿瘤起始活性以及靶向TCF7可以减轻多种癌细胞对化疗药物的耐药性。通过对基因表达综合数据库(gene expression omnibus database, GEO)中CML临床样本基因表达谱数据的分析，我们发现TCF7在CML急变期的干祖细胞群里高表达，更为关键的是伊马替尼(imatinib, IM)耐药的CML细胞中TCF7的升高更为显著。然而在CML疾病进展和耐药的研究中，TCF7的作用及其分子机制还有许多不明之处。
目的：
1.探查CML病程进展过程中以及IM耐药发生时转录组整体水平变化以确定重要信号通路与关键基因。
2.评估关键基因TCF7与BCR-ABL1的相关性。
3.研究TCF7对IM耐药CML细胞增殖以及药物敏感性的影响。
4.明确IM处理、TCF7沉默以及二者联合对IM耐药CML细胞的转录组影响。
5.阐明TCF7影响的关键通路与效应分子。
方法：
1.利用基因表达谱数据甄别与CML进展耐药相关的重要信号通路与关键基因。
(1)利用基因集富集分析软件(gene set enrichment analysis, GSEA)结合hallmark基因集分析GEO数据库中的基因表达谱数据集GSE47927(含正常人以及CML慢性期、加速期与急变期的临床样本)以及GSE4170(含IM耐药以及IM敏感的临床样本)，通过Cytoscape软件可视化GSEA分析的结果，而后借助基因表达热力图观察重要信号通路基因的表达情况。
(2)以mRNA表达值的两倍差异(即|Log2Foldchange|>1)作为阈值分别从GSE47927、GSE4170、GSE10912和GSE78734四个基因表达谱数据集中获得参与CML进展、CML耐药以及白血病细胞分化相关，但是与BCR-ABL1的表达与功能不相关的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，而后以关键信号通路的基因集做筛选，即通过五者交集，筛选出候选靶基因。
2.在白血病细胞系(K562/G01、KCL22、HL60以及NB4)中验证TCF7的mRNA与蛋白的表达。使用IM抑制IM耐药的CML细胞系K562/G01中BCR-ABL1活性，通过qPCR与Westernblot检测TCF7、BCR-ABL1的表达变化。
3.TCF7沉默对IM耐药细胞增殖与耐药性的影响
(1 )使用LV-Scramble以及LV-TCF7-RNAi重组慢病毒感染K562/G01细胞，分别作为对照组(Scramble)与实验组(TCF7_KD)。使用嘌呤霉素筛选感染的细胞。通过荧光显微镜与流式细胞仪检测感染效率，通过qPCR以及Westernblot分别检测TCF7在mRNA水平与蛋白水平的表达变化，通过细胞免疫荧光(immunocytofluorescent，ICF)实验观察TCF7在细胞的定位与表达情况。
(2)通过细胞计数与细胞活力检测TCF7沉默对K562/G01细胞增殖的影响，通过碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色以及AnnexinV/DAPI双染色法分别检测细胞周期与细胞凋亡。
(3)通过拟合药敏曲线测量IM对Scramble组与TCF7_KD组细胞的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration，IC50)。通过细胞活力实验与流式细胞术分别检测Scramble组与TCF7_KD组细胞在IM低浓度的作用下的细胞活力与含EGFP荧光的细胞比率。使用甲基纤维素半固体培养基检测单个细胞集落形成能力。
4.应用RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)技术检测以常规剂量IM处理或不处理的Scramble组与TCF7_KD组K562/G01细胞的转录组，获得Scramble、IM、TCF7_KD以及TCF7_KD+IM四组数据。随后，对四组数据进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。进一步，以Scramble组为参照，利用GSEA分析信号通路的变化。此外，通过对TCF7_KD组的DEGs进行基因本体论(gene ontology，GO)富集分析，获得相关下游效应分子的重要线索。
5.信号通路串联分析与靶基因验证。
(1)综合分析ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路在IM、TCF7_KD以及TCF7_KD+IM组的变化趋势。借助单细胞测序数据集GSE76312进行TCF7单基因GSEA分析，以确定TCF7的表达与ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路基因的表达的相关性。通过qPCR与Westernblot验证TCF7沉默对信号通路关键成分的影响。
(2)利用DNA元件百科全书(The Encyclopedia of DNA Elements， ENCODE)数据库的ChIP-seq数据ENCFF476IUK.bigWig作为辅助分析确定TCF7在靶基因启动子上结合的区域，而后应用ChIP-qPCR实验证实。
结果：
1.与CML进展和耐药相关的重要信号通路与关键基因。
(1)综合CML在不同的病程以及对IM的耐药性的分子特征，CML细胞发生改变信号通路分成A、B、C和D四组。A组在CML慢性期、加速期、急变期以及IM耐药的CML细胞中呈现强化状态，比如Wnt/β-catenin信号以及血红素代谢等。B组同时在急变期与耐药时增强，比如Notch信号、炎症反应以及TGF-β信号等。而C组在急变期与耐药中变化趋势相反，比如低氧以及INF-γ信号等。D组在急变期与耐药中同时减弱，比如DNA修复、活性氧类物质以及胆汁酸代谢等。
(2)基因表达的热力图中显示，A组信号通路的基因大多数在CML急变期表达增高。其中，TCF7尤其在分化特征更为原始的细胞中显著高表达。
(3 )综合五个基因集合取交集获得关键基因TCF7。在数据集GSE47927中，TCF/LEF家族成员(TCF7、TCF7L1、TCF7L2、LEF1)里，只有TCF7的表达在急变期显著上调。在数据集GSE4170中，TCF7在IM耐药组的表达为IM敏感组的12倍。
2.在细胞系中的验证结果表明，TCF7相对特异的表达于CML细胞系K562/G01与KCL22。IM处理K562/G01细胞的结果显示，常规剂量(1μM)的IM对BCR-ABL1以及TCF7并未造成影响，而大剂量(5μM)的IM虽然抑制了BCR-ABL1的活性且导致了部分细胞的凋亡，但仍未对TCF7的mRNA与蛋白的表达造成影响。
3.TCF7沉默抑制K562/G01细胞增殖和伊马替尼耐药。
(1)慢病毒感染的K562/G01细胞在经过嘌呤霉素筛选之后，在荧光显微镜下显示绿色荧光，流式细胞仪显示FL1通道细胞阳性率接近100%。Westernblot与qPCR结果显示TCF7_KD组的TCF7的表达水平下调80%~90%，ICF实验更为直观的显示TCF7定位于细胞核，TCF7_KD组细胞核中TCF7的荧光强度显著降低。
(2 )细胞计数以及细胞活力检测显示，与Scramble组相比，TCF7_KD组细胞增殖受到抑制。细胞周期检测结果显示TCF7_KD组的G0/G1期细胞增多,而S+G2/M期的细胞减少。此外，TCF7_KD组Sub-G1峰的细胞显著增多，这与细胞凋亡检测结果一致，二者均提示凋亡增多。
(3)根据所拟合的药敏曲线参数，IM对Scramble组的IC50值为8.3μM，TCF7_KD组的下降为4.7μM。细胞活力实验显示当IM浓度从0.5μM提高到1.0μM的时候，Scramble组细胞的细胞活力未受影响，而TCF7_KD组明显降低。与之一致的是，流式细胞术检测结果显示EGFP荧光细胞的比率在TCF7_KD组也显著降低。细胞集落形成实验显示TCF7沉默联合IM可显著抑制耐药细胞的集落形成率。
4.对K562/G01细胞四个转录组测序数据的PCA结果显示，TCF7_KD+IM组相对于Scramble组有更大的特征偏移。GSEA分析显示，在TCF7沉默与IM联合处理时，可对Wnt/β-catenin信号产生中和作用，对INF-α反应信号产生协同作用。TCF7_KD组中1034个DEGs的GO_biologicalprocess术语富集分析显示，ABCC2为核心富集基因之一。
5.KEGG信号通路分析结果显示：ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路在IM组出现增强，在TCF7_KD组出现降低，在TCF7_KD+IM组呈现中和状态。结果表明ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路在不同的因素处理时变化趋势一致，二者存在串联。TCF7单基因GSEA分析结果显示，TCF7的表达与ABCtransporters以及Wnt/β-catenin信号通路分子的表达正相关。Westernblot结果显示TCF7沉默引起CTNNB1、CCND1以及ABCC2的降低，qPCR结果显示TCF7沉默引起CCND1和ABCC2的mRNA表达降低。ChIP-qPCR结果显示K562/G01细胞中TCF7对ABCC2的启动子区域存在直接结合。
结论：
1.Wnt/β-catenin信号通路的增强与CML进展与耐药密切相关，其下游转录因子TCF7在CML急变与耐药细胞中显著高表达。
2.TCF7独立于BCR-ABL1的活性。
3.TCF7沉默可以抑制CML耐药细胞K562/G01的增殖与耐药。
4.IM引起INF-α与Wnt/β-catenin信号上调，TCF7沉默可以分别起到协同与中和的作用。
5.TCF7沉默可以中和在IM的作用下强化的Wnt/β-catenin/TCF7/ABC-transporters信号轴。ABCC2是TCF7直接转录的靶基因。
目的：
1.探查CML病程进展过程中以及IM耐药发生时转录组整体水平变化以确定重要信号通路与关键基因。
2.评估关键基因TCF7与BCR-ABL1的相关性。
3.研究TCF7对IM耐药CML细胞增殖以及药物敏感性的影响。
4.明确IM处理、TCF7沉默以及二者联合对IM耐药CML细胞的转录组影响。
5.阐明TCF7影响的关键通路与效应分子。
方法：
1.利用基因表达谱数据甄别与CML进展耐药相关的重要信号通路与关键基因。
(1)利用基因集富集分析软件(gene set enrichment analysis, GSEA)结合hallmark基因集分析GEO数据库中的基因表达谱数据集GSE47927(含正常人以及CML慢性期、加速期与急变期的临床样本)以及GSE4170(含IM耐药以及IM敏感的临床样本)，通过Cytoscape软件可视化GSEA分析的结果，而后借助基因表达热力图观察重要信号通路基因的表达情况。
(2)以mRNA表达值的两倍差异(即|Log2Foldchange|>1)作为阈值分别从GSE47927、GSE4170、GSE10912和GSE78734四个基因表达谱数据集中获得参与CML进展、CML耐药以及白血病细胞分化相关，但是与BCR-ABL1的表达与功能不相关的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，而后以关键信号通路的基因集做筛选，即通过五者交集，筛选出候选靶基因。
2.在白血病细胞系(K562/G01、KCL22、HL60以及NB4)中验证TCF7的mRNA与蛋白的表达。使用IM抑制IM耐药的CML细胞系K562/G01中BCR-ABL1活性，通过qPCR与Westernblot检测TCF7、BCR-ABL1的表达变化。
3.TCF7沉默对IM耐药细胞增殖与耐药性的影响
(1 )使用LV-Scramble以及LV-TCF7-RNAi重组慢病毒感染K562/G01细胞，分别作为对照组(Scramble)与实验组(TCF7_KD)。使用嘌呤霉素筛选感染的细胞。通过荧光显微镜与流式细胞仪检测感染效率，通过qPCR以及Westernblot分别检测TCF7在mRNA水平与蛋白水平的表达变化，通过细胞免疫荧光(immunocytofluorescent，ICF)实验观察TCF7在细胞的定位与表达情况。
(2)通过细胞计数与细胞活力检测TCF7沉默对K562/G01细胞增殖的影响，通过碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色以及AnnexinV/DAPI双染色法分别检测细胞周期与细胞凋亡。
(3)通过拟合药敏曲线测量IM对Scramble组与TCF7_KD组细胞的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration，IC50)。通过细胞活力实验与流式细胞术分别检测Scramble组与TCF7_KD组细胞在IM低浓度的作用下的细胞活力与含EGFP荧光的细胞比率。使用甲基纤维素半固体培养基检测单个细胞集落形成能力。
4.应用RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)技术检测以常规剂量IM处理或不处理的Scramble组与TCF7_KD组K562/G01细胞的转录组，获得Scramble、IM、TCF7_KD以及TCF7_KD+IM四组数据。随后，对四组数据进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。进一步，以Scramble组为参照，利用GSEA分析信号通路的变化。此外，通过对TCF7_KD组的DEGs进行基因本体论(gene ontology，GO)富集分析，获得相关下游效应分子的重要线索。
5.信号通路串联分析与靶基因验证。
(1)综合分析ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路在IM、TCF7_KD以及TCF7_KD+IM组的变化趋势。借助单细胞测序数据集GSE76312进行TCF7单基因GSEA分析，以确定TCF7的表达与ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路基因的表达的相关性。通过qPCR与Westernblot验证TCF7沉默对信号通路关键成分的影响。
(2)利用DNA元件百科全书(The Encyclopedia of DNA Elements， ENCODE)数据库的ChIP-seq数据ENCFF476IUK.bigWig作为辅助分析确定TCF7在靶基因启动子上结合的区域，而后应用ChIP-qPCR实验证实。
结果：
1.与CML进展和耐药相关的重要信号通路与关键基因。
(1)综合CML在不同的病程以及对IM的耐药性的分子特征，CML细胞发生改变信号通路分成A、B、C和D四组。A组在CML慢性期、加速期、急变期以及IM耐药的CML细胞中呈现强化状态，比如Wnt/β-catenin信号以及血红素代谢等。B组同时在急变期与耐药时增强，比如Notch信号、炎症反应以及TGF-β信号等。而C组在急变期与耐药中变化趋势相反，比如低氧以及INF-γ信号等。D组在急变期与耐药中同时减弱，比如DNA修复、活性氧类物质以及胆汁酸代谢等。
(2)基因表达的热力图中显示，A组信号通路的基因大多数在CML急变期表达增高。其中，TCF7尤其在分化特征更为原始的细胞中显著高表达。
(3 )综合五个基因集合取交集获得关键基因TCF7。在数据集GSE47927中，TCF/LEF家族成员(TCF7、TCF7L1、TCF7L2、LEF1)里，只有TCF7的表达在急变期显著上调。在数据集GSE4170中，TCF7在IM耐药组的表达为IM敏感组的12倍。
2.在细胞系中的验证结果表明，TCF7相对特异的表达于CML细胞系K562/G01与KCL22。IM处理K562/G01细胞的结果显示，常规剂量(1μM)的IM对BCR-ABL1以及TCF7并未造成影响，而大剂量(5μM)的IM虽然抑制了BCR-ABL1的活性且导致了部分细胞的凋亡，但仍未对TCF7的mRNA与蛋白的表达造成影响。
3.TCF7沉默抑制K562/G01细胞增殖和伊马替尼耐药。
(1)慢病毒感染的K562/G01细胞在经过嘌呤霉素筛选之后，在荧光显微镜下显示绿色荧光，流式细胞仪显示FL1通道细胞阳性率接近100%。Westernblot与qPCR结果显示TCF7_KD组的TCF7的表达水平下调80%~90%，ICF实验更为直观的显示TCF7定位于细胞核，TCF7_KD组细胞核中TCF7的荧光强度显著降低。
(2 )细胞计数以及细胞活力检测显示，与Scramble组相比，TCF7_KD组细胞增殖受到抑制。细胞周期检测结果显示TCF7_KD组的G0/G1期细胞增多,而S+G2/M期的细胞减少。此外，TCF7_KD组Sub-G1峰的细胞显著增多，这与细胞凋亡检测结果一致，二者均提示凋亡增多。
(3)根据所拟合的药敏曲线参数，IM对Scramble组的IC50值为8.3μM，TCF7_KD组的下降为4.7μM。细胞活力实验显示当IM浓度从0.5μM提高到1.0μM的时候，Scramble组细胞的细胞活力未受影响，而TCF7_KD组明显降低。与之一致的是，流式细胞术检测结果显示EGFP荧光细胞的比率在TCF7_KD组也显著降低。细胞集落形成实验显示TCF7沉默联合IM可显著抑制耐药细胞的集落形成率。
4.对K562/G01细胞四个转录组测序数据的PCA结果显示，TCF7_KD+IM组相对于Scramble组有更大的特征偏移。GSEA分析显示，在TCF7沉默与IM联合处理时，可对Wnt/β-catenin信号产生中和作用，对INF-α反应信号产生协同作用。TCF7_KD组中1034个DEGs的GO_biologicalprocess术语富集分析显示，ABCC2为核心富集基因之一。
5.KEGG信号通路分析结果显示：ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路在IM组出现增强，在TCF7_KD组出现降低，在TCF7_KD+IM组呈现中和状态。结果表明ABCtransporters与Wnt/β-catenin信号通路在不同的因素处理时变化趋势一致，二者存在串联。TCF7单基因GSEA分析结果显示，TCF7的表达与ABCtransporters以及Wnt/β-catenin信号通路分子的表达正相关。Westernblot结果显示TCF7沉默引起CTNNB1、CCND1以及ABCC2的降低，qPCR结果显示TCF7沉默引起CCND1和ABCC2的mRNA表达降低。ChIP-qPCR结果显示K562/G01细胞中TCF7对ABCC2的启动子区域存在直接结合。
结论：
1.Wnt/β-catenin信号通路的增强与CML进展与耐药密切相关，其下游转录因子TCF7在CML急变与耐药细胞中显著高表达。
2.TCF7独立于BCR-ABL1的活性。
3.TCF7沉默可以抑制CML耐药细胞K562/G01的增殖与耐药。
4.IM引起INF-α与Wnt/β-catenin信号上调，TCF7沉默可以分别起到协同与中和的作用。
5.TCF7沉默可以中和在IM的作用下强化的Wnt/β-catenin/TCF7/ABC-transporters信号轴。ABCC2是TCF7直接转录的靶基因。