一、研究背景:全球每年大约有100到200万人被诊断为结直肠癌,死于结直肠癌人数超过60万。结直肠癌的发生是一个多阶段、多步骤过程,其中多种癌基因活化和抑癌基因的失活是导致结直肠癌发生和发展的关键因素。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是参与肿瘤发生和转移的一个重要表观遗传学调控因子。lncRNA-MEG3是最早被发现具有肿瘤抑制功能的一条lncRNA,在多种肿瘤组织和细胞中表达受到抑制。研究发现MEG3具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的能力。目前已研究表明MEG3可通过促进p53表达或结合某些miRNA分子来发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。然而目前lncRNA相关研究发现lncRNA可以通过多种方式在不同层面上参与基因表达调控从而导致肿瘤的发生。MEG3在结肠癌发生作用及相关分子机制有待进一步探讨。在本课题中,我们将首先从临床组织样本出发,探讨结直肠癌中MEG3与临床病理特征的关系以及对患者预后评估的价值。并通过体内/外实验检测MEG3在结直肠癌中的生物学功能。在此基础上,我们对MEG3抑制结直肠癌作用的调控机制展开了深入探索,为进一步临床转化提供理论基础。二、实验方法:1.检测MEG3在结直肠癌与癌旁组织中的表达:通过实时定量PCR检测61对结直肠癌及癌旁新鲜组织中MEG3表达水平的变化;原位杂交技术检测27对结直肠癌与癌旁石蜡切片中MEG3表达情况。通过原位杂交技术检测结直肠癌组织芯片中MEG3的表达,并通过统计学分析MEG3与临床病理特征以及患者生存预后间的关系。2.通过体内外实验分别检测MEG3的表达对结直肠癌生物学特性的影响:体外实验:采用CCK8实验检测MEG3对细胞增殖能力的影响;采用Transwell实验检测MEG3对细胞迁移和侵袭能力的影响;通过流式细胞仪检测MEG3对细胞凋亡的影响。体内实验:建立裸鼠结直肠癌荷瘤生长模型,考察MEG3对结直肠癌细胞体内成瘤的影响;建立裸鼠肺转移瘤模型,考察MEG3对结直肠癌转移的影响。3.MEG3上游调控基因的检测:通过生物信息学分析在MEG3的启动子区域有可能结合的转录因子;通过细胞实验和组织芯片进一步验证MEG3与转录因子VDR的相关性;利用荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀技术进一步验证VDR和活性维生素D是否可以调控MEG3的表达。4.MEG3对结直肠癌抑制作用的机制研究:通过RNA-pulldown技术和质谱分析筛选获得与MEG3潜在结合的靶蛋白分子。通过Westernblot和RNA免疫共沉淀技术验证靶蛋白CLU与MEG3的相互结合;通过emsa技术进一步验证MEG3与靶蛋白直接结合,再将各截短MEG3片段分别与靶蛋白共孵育,通过EMSA实验检测靶蛋白与MEG3绑定的区域;通过CCK8,transwell实验验证MEG3通过下游靶蛋白影响肠癌的增殖、迁移和侵袭的功能;利用实时定量PCR和Westernblot技术检测过表达MEG3肠癌细胞株中下游靶蛋白的表达情况。三、实验结果:1.MEG3在结直肠癌中低表达及其与结直肠癌患者预后不良有关1.1MEG3在结直肠癌组织中的表达:通过实时定量PCR实验和原位杂交技术检测癌与癌旁组织中MEG3的表达水平,发现癌旁组织中MEG3的表达量明显高于结直肠癌组织中的表达,差异具有统计学意义（p<0.05）。1.2总生存期患者MEG3的表达与结直肠癌临床病理特征及预后的关系:采用Kaplan-meier分析总生存期MEG3表达高的患者生存期也明显长于MEG3低表达患者（p=0.007）。采用cox比例回归模型对总生存期进行单因素分析发现MEG3的表达、tnm分期、CEA和CA199和结直肠癌患者生存预后具有相关性（p<0.05）;而结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤的浸润深度、肿瘤部位、肿瘤分化程度等临床病理特征与患者生存预后无关,不具有统计学意义。采用多因素矫正后分析,发现MEG3低表达、结直肠癌的TNM分期和CEA水平是影响结直肠癌患者生存预后的独立风险因素。1.3无瘤生存期患者MEG3的表达与结直肠癌临床病理特征及预后的关系:Kaplan-meier分析发现无瘤生存期（DFS）MEG3表达高的患者生存期明显长于MEG3低表达患者（p=0.003）。对dfs进行cox单因素分析,发现MEG3的表达、TNM分期和CEA与DFS显著相关（p<0.05）;而其他临床病理特征与结直肠癌患者DFS不相关,不具有统计学意义。再采用多因素矫正后分析,发现MEG3的表达、结直肠癌的TNM分期和CEA是影响结直肠癌患者DFS的独立风险因素。2.MEG3的高表达抑制结直肠癌成瘤和转移2.1CCK8实验表明:与空质粒对照组和空白对照组相比,MEG3过表达质粒转染细胞株后,细胞增殖活性明显降低;与NC对照组和空白对照组相比,MEG3siRNA转染细胞株后,细胞增殖活性明显增快。2.2Transwell实验表明:MEG3过表达组比空质粒对照组和空白对照组细胞迁移、侵袭能力明显下降（p<0.05）。MEG3siRNA转染RKO细胞株后细胞迁移、侵袭能力明显高于阴性对照和空白对照组（p<0.01）2.3流式细胞仪检测细胞凋亡实验:MEG3过表达后可促进细胞株的凋亡。MEG3敲低后细胞凋亡能力明显减低。2.4裸鼠皮下成瘤实验表明:通过测量裸鼠皮下肿瘤体积,发现MEG3过表达组肿瘤组织体积明显小于空载体对照组。2.5肺转移瘤实验表明:通过尾静脉注射后取出裸鼠肺组织观察转移瘤个数,MEG3过表达组肺转移瘤个数明显少于空载体对照组。3.VDR特异性结合MEG3上游启动子区并激活MEG3的表达3.1生物物信息学分析发现在MEG3子的启动子区域存在VDR反应元件结合位点。荧光素酶报告实验发现VDR能够激活含有MEG3启动子区的荧光素酶报告基因质粒。chip实验检测发现转录起始点前-230^-243碱基区vdr抗体富集片段明显,进一步证实了vdr能够与MEG3上游启动子区结合。3.2检测VDR与MEG3的相关性:3.2.1SW1116细胞实验组中,1α,25-（OH）₂D处理组24小时和48小时后MEG3的表达比无水乙醇对照组和空白对照组明显升高（p<0.001）;RKO细胞实验组中,处理48小时后1α,25-（OH）₂D处理组MEG3的表达量比无水乙醇对照组和空白对照组明显升高（p<0.05）。3.2.2转染VDR过表达质粒的sw1116细胞株和RKO细胞株中,在24、48和72小时以后MEG3表达水平明显高于转染空载体细胞株（p<0.001）,而且转染时间越长,MEG3表达量越高。3.2.3在结直肠癌组织中VDR表达量越低MEG3的表达水平也越低,因此在结直肠癌组织中vdr和MEG3表达情况具有显著相关性p<0.001。3.2.4结直肠癌组织中VDR高表达患者总生存期明显长于vdr低表达患者。4.MEG3特异性结合下游靶蛋白CLU抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭4.1通过生物素MEG3反义RNA进行RNA沉降实验,发现与反义RNA和无磁珠对照比较获得与MEG3特异性结合的蛋白质条带,切胶并进行质谱鉴定。经质谱分析发现多个MEG3潜在结合蛋白分子。4.2RNA-pulldown结合特异抗体westernblot验证发现lyar和在正义链和反义链及无磁珠对照组中没有明显的差异,CLU在正义链沉淀组中明显富集,提示CLU有可能与MEG3结合。4.3RIP实验证实:MEG3在CLU抗体沉淀组中明显富集,提示MEG3能够同CLU蛋白结合。4.4emsa实验表明:MEG3能够与CLU蛋白及CLU抗体结合形成RNA-蛋白-抗体三元复合物,证实MEG3能够与CLU蛋白直接结合。4.5 MEG3截短实验证实:MEG3 732-1174片段能够与CLU蛋白特异性结合。4.6通过CCK8和Transwell实验检测SW1116/si-CLU、SW1116/MEG3,SW1116/MEG3/CLU及空白对照细胞的增殖、迁移和侵袭能力,发现同时过表达MEG3和CLU的肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显高于单独干扰CLU或MEG3过表达的肠癌细胞株,其增殖、迁移和侵袭能力与空白肠癌细胞相当,证实MEG3可以通过下游分子CLU参与结直肠癌的增殖、迁移和侵袭。四、研究结论:1.在组织水平发现MEG3在结直肠癌组织中表达水平明显低于癌旁组织;MEG3的表达水平、临床TNM分期、CEA水平与患者预后具有显著相关性,而且MEG3低表达水平与结直肠癌患者的预后不良相关。2.MEG3作为肿瘤抑制基因抑制结直肠癌的成瘤和转移。3.核转录因子VDR能够特异性结合MEG3上游启动子区VDR反应元件的结合位点,结直肠癌组织和细胞中VDR可以促进MEG3表达增高,维生素D信号通路的异常活化可能是结直肠癌组织和细胞中MEG3异常表达的重要通路和方式。4.MEG3的732-1174区域能够与下游靶蛋白分子CLU特异性结合形成RNA-蛋白复合物,降低癌基因CLU在结直肠癌中的稳定性,进而抑制结直肠癌的增殖、迁移和转移。