研究背景：祖国医学认为“脾主涎”、“脾在液为涎”,涎即唾液。唾液中最重要的蛋白是唾液淀粉酶(sAA),占唾液蛋白的40-一50%,很多学者利用sAA活性对脾虚证本质进行了研究。广州中医药大学脾胃研究所王建华教授带领的团队于上世纪70年代首次发现脾虚证患者在柠檬酸酸刺激后sAA活性下降,此后该研究得到国内多个单位的重复,且在不同疾病的脾气虚证患者中得到验证,1993年卫生部将该指标列入《中药新药临床指导原则》作为脾气虚证疗效的评价指标。sAA活性变化是脾虚证候研究中的典型范例,然而在对脾虚证患者sAA活性进一步研究中也发现了一些不足之处,如在多种疾病脾虚证中检出率约为60%,特异性不高,指标背后的的深层次信息如调控因素、干扰因素等缺乏深入研究,影响了该指标反映脾虚证候本质的特异性。既往研究发现sAA主要以非糖基化和N-糖基化形式存在,糖基化的sAA根据其生物活性强弱从高至低分为复合型、杂合型、高甘露糖型3种亚型。sAA活性改变这一生化指标改变现象的背后,可能与sAA糖基化与非糖基化的存在情况、sAA糖基化3种亚型的比例改变等分子背景有重要关联。因此有必要从N糖基化及其亚型结构角度深入探讨脾气虚证患者sAA活性改变的分子机制及影响因素。研究目的：初步探讨脾气虚证临床症候与sAA活性比值之间的关联性;通过对两种不同系统疾病(慢性浅表性胃炎与重症肌无力),脾气虚证(虚证)、脾虚湿热证(虚实夹杂)及肝胃不和证(实证)患者sAA活性、N-糖基化蛋白表达及N-糖链亚型构成比的观察,以健康志愿者为对照,在分子水平探讨脾气虚证患者sAA活性改变的机制,为祖国医学“脾主涎”理论的科学内涵提供依据。研究内容本课题选取了两种疾病三种中医证型：消化系统疾病——慢性浅表性胃炎(CSG)脾气虚证、脾虚湿热证与肝胃不和证；非消化系统疾病——重症肌无力(MG)脾气虚证及脾虚湿热证,分别观察sAA活性、sAAN-糖基化蛋白表达及sAAN-糖链亚型构成比的变化情况,并对比分析脾气虚证(虚证)、脾虚湿热证(虚实夹杂)及肝胃不和证(实证)患者sAA各指标间的差异,从异病同证角度验证脾气虚证患者sAA的变化规律,并从N-糖基化角度探讨脾气虚证患者sAA活性改变的机制。材料与方法：1.研究对象符合诊断标准的MG患者61例,其中脾气虚证患者33例,脾虚湿热证患者23例,脾肾亏虚5例(因例数较少,暂未分析其指标)；慢性浅表性胃炎患者101例,其中脾气虚证患者36例,脾虚湿热证患者40例,肝胃不和证25例,同时选取健康志愿者36例。2.研究方法2.1受试患者情况分析建立MG及CSG各证型患者的临床症候表现数据库,进行频次及逐步回归分析,观察不同中医证型的症候表现,作为症候与sAA活性关联性研究的基础。2.2唾液样本采集使用专用唾液采集管,以口内转动棉柱法采集唾液样本。按住院部患者(MG患者)与门诊患者(CSG患者)时间安排在不同的时间采集,MG患者于6：30-7：30am采集,CSG患者于9：00～10：30am采集,健康志愿者也分为这两个时间段采集以确保可与患者组在同一时间段平行比较各指标。采集的唾液样本经离心后取上清液,-80℃保存备用。2.3 sAA活性检测采用Bernfeld方法检测sAA活性,同时计算sAA活性比值(酸负荷后sAA活性／酸负荷前sAA活性)。2.4初步分析sAA活性比值与临床症候之间的关联性通过逐步线性回归分析法初步探讨临床症候与sAA活性比值之间的关联性。2.5健康者及各证型患者sAA糖基化程度研究采用western blot法,以人sAA生物标准品为参照,对比观察健康者及各证型患者sAAN-糖蛋白表达,分析各证型患者sAAN-糖基化蛋白缺失情况。2.6 sAAN-糖链亚型构成比分析检测健康者及MG与CSG各证型患者与刀豆凝集素(conA)及麦胚凝集素(WGA)结合前后的sAA活性,并按公式：与凝集素的结合率=[(结合前sAA活性-结合后sAA活性)／结合前sAA活性]×100%,计算sAA与conA及WGA的结合率；进一步以conA与WGA进行凝集素亲和层析实验,分析N-糖链中高甘露糖型、杂合型及复合型糖链的构成比情况。2.7植物凝集素的筛选定制凝集素芯片,筛选出与健康组、MG脾气虚证及脾虚湿热证患者sAA结合区别较大的凝集素,并再次以lectin Blot法进行验证,为下一步深入研究sAAN糖链类型研究打下基础。研究结果1.受试者一般资料CSG患者101例,年龄21-60岁,平均年龄40.1±12.1岁,男性44例,女性57例,其中脾气虚证患者36例,脾虚湿热证患者40例,肝胃不和证患者40例；MG患者61例,年龄20-65岁,平均48.1±14.7岁；男性24例,女性37例,其中脾气虚证患者33例,脾虚湿热证患者23例,脾肾亏虚证患者5例(因脾肾亏虚证患者例数较少,故暂未分析其指标)。健康志愿者36例,年龄20-35岁,平均年龄28.3±5.8岁。2.CSG与MG各证型患者临床症候结果CSG脾气虚证患者以舌淡、脉浮细弱、唇色暗淡、呃逆、食后腹胀、身重困倦、嗳气、肠鸣音亢进、脘腹疼痛、肢体倦怠、大便溏泄等症出现频率较高；脾虚湿热型患者以舌红、脉沉濡数、唇色暗淡、胃脘胀满、食后腹胀、身重困倦、嗳气、呃逆等症多见；肝胃不和型主症表现为：脉弦,舌淡,脘腹胀满或疼痛、嗳气、情志抑郁等症。其中脾气虚证患者食后腹胀、呃逆、口泛清涎、舌淡、脉浮细弱等症的出现显著频率高于脾虚湿热证及肝胃不和证患者(P<0.01)。MG脾气虚证患者多见脉浮细弱、舌淡、眼睑下垂、表情呆板、四肢无力、眼球活动不灵活、多汗、面色晦暗、神疲懒言、食欲减退等症；脾虚湿热证患者多见脉沉濡弱、多汗、咀嚼无力、表情呆板、四肢无力、面色晦暗、身重困倦、渴欲饮水等症。脾气虚证患者食欲减退、口泛清涎、舌淡、脉浮细弱、眼睑下垂、眼球活动不灵活等症的出现频率显著高于脾虚湿热证(P<0.01),此结果可为进一步探讨脾气虚证临床症候与sAA活性比值之间关系的基础。3.sAA活性检测结果健康志愿者酸负荷后sAA活性升高,CSG、MG脾气虚组与脾虚湿热组患者酸负荷后sAA活性下降,CSG肝胃不和组患者酸负荷后sAA活性升高；CSG、MG脾气虚证及脾虚湿热证患者sAA活性比值(酸负荷后/酸负荷前)与健康组相比明显降低(P<0.05),CSG肝胃不和组患者sAA活性比值与健康组相比无差异。提示脾虚病理状态(包括脾虚湿热)在酸负荷前sAA活性可代偿性升高,而应激力下降,导致在酸负荷后sAA活性的下降,sAA活性比值降低。4.临床症状与sAA活性比值的关联性结果通过逐步线性回归分析发现CSG脾气虚证患者sAA活性比值与食后腹胀、脘腹疼痛、呃逆三个症候关联性较大,且均呈负相关；MG脾气虚证患者sAA活性比值与口泛清涎、食欲减退、眼睑下垂三个症候关联性较大,且呈负相关。CSG、MG其它证型均未发现与sAA活性比值有明显相关性的症候。因此提示脾气虚证患者的某些临床症候与sAA活性比值之间的关系较其它证型更为密切。5. sAAN-糖基化研究5.1 sAAN-糖基化程度分析56.7%(17/30)的MG脾气虚患者与36.4%(8/22)的MG脾虚湿热患者出现sAAN-糖基化蛋白表达缺失,明显高于健康组的11.1%(4/36)(P<0.05),25.0%(8/32)CSG脾气虚证及31.7%(13/41)的CSG脾虚湿热证出现sAAN-糖基化蛋白表达缺失,明显高于健康组的11.1%(P<0.05),而CSG肝胃不和证患者sAA N-糖基化蛋白缺失比例为8.7%(2/23),与健康者无差异,提示脾气虚证及脾虚湿热证患者sAAN-糖基化蛋白表达缺失是sAA活性改变的病理背景之一。5.2 sAA N-糖链亚型结构分析结果5.2.1各组sAA与conA及WGA结合率结果比较sAA与conA及WGA结合率比较结果显示,MG脾气虚组、脾虚湿热组与CSG脾气虚组、脾虚湿热组患者酸负荷前、后sAA与conA的结合率均明显高于健康者组(P<0.05),提示脾气虚证及脾虚湿热证患者sAA中高甘露糖型及杂合型(生物活性较弱)蛋白构成比高于健康者组；MG脾气虚组、脾虚湿热组及CSG脾气虚组、脾虚湿热组患者酸负荷前、后sAA与WGA结合率均低于健康组(P<0.05),说明复合型糖链(生物活性较强)的构成比低于健康组,CSG肝胃不和组患者sAA与conA及WGA的结合率与健康组相比均无明显差异,说明实证患者sAA糖链结构无明显改变。5.2.2各组sAA与conA及WGA亲和层析结果比较MG、CSG脾气虚组及脾虚湿热组患者sAA与conA亲和层析结果分别显示弱结合峰面积与强结合峰面积峰面积高于未结合峰面积峰面积,说明脾气虚组及脾虚湿热组患者sAA中高甘露糖及杂合型糖链构成比大于复合型糖链。MG、CSG脾气虚组与脾虚湿热组患者sAA与WGA亲和层析结果显示,脾气虚组患者未结合峰面积高于结合峰面积,脾虚湿热组患者结合峰面积高于未结合峰面积,说明脾气虚组患者sAA中复合型糖链构成比降低,脾虚湿热证患者sAA中杂合型与复合型糖链构成比升高。综合sAA与conA层析结果可推测脾气虚组患者sAA中生物活性较弱的高甘露糖型糖链构成比较高,脾虚湿热组患者sAA中杂合型糖链构成比较高。结果提示, N-糖链中生物活性较弱的高甘露糖型糖链含量升高、生物活性较强复合性糖链含量降低是sAA活性下降的因素之一。6.其他植物凝集素的筛选6.1 LectinTM凝集素芯片结果与健康组相对照,发现番茄凝集素(LEL)、马铃薯凝集素(STL)与麦胚凝集素(WGA)3个凝集素在健康组、重症肌无力脾气虚证及脾虚湿热证患者唾液样本中具有一定的区分能力,其中WGA在3组样本中表现出较大的差异。可进选用这三种凝集素进行下一步的深入研究。6.2凝集素芯片验证结果通过Lectin blot实验发现脾虚湿热证患者sAA与WGA、LEL、STL结合的糖蛋白表达均高于健康者,比较三种凝集素结合糖链特异性可推断本组MG脾虚湿热证患者sAA中含有GlcNAc糖链结构增多。提示WGA、LEL、STL所结合的糖蛋白在健康者与MG脾虚湿热者之间有明显的区分能力,可用于进一步深入研究sAA糖链结构类型。研究结论：重症肌无力及慢性浅表性胃炎脾气虚证(虚证)与脾虚湿热证(虚实夹杂)患者在酸负荷后均表现为sAA活性下降,sAA活性比值降低(<1),N-糖基化蛋白缺失及N-糖链构成比的改变可能是影响sAA活性变化的主要因素之一。