慢性疼痛是危害人类健康的严重问题。数据显示,全球成人慢性疼痛的平均发病率约为30%,由于其病因复杂,发病机制尚不明确,治疗非常困难。长期遭受慢性疼痛的患者,极易伴随着焦虑、失眠、忧郁、抑郁等症状,不仅耗费大量医疗资源,患者自身的生活质量也严重下降。因此,如何有效的治疗慢性疼痛已经成为临床急待解决的挑战性问题。慢性疼痛的类型主要有以下几种,包括组织损伤(例如关节炎)后的炎性疼痛,癌症疼痛和神经损伤、脊髓损伤和脑损伤后的神经性疼痛(例如中风和创伤)。慢性疼痛的特征通常在于痛觉过敏,其是对有害的热和机械刺激以及异常性疼痛的增加的反应,其中伤害性反应发生于正常无害的刺激,例如轻微接触(称为机械性异常性疼痛)。神经性疼痛的特征还在于灼烧疼痛,感觉异常(刺痛感,瘙痒)和感觉迟钝(不愉快的,异常的触觉)。缓解慢性疼痛的常规药物治疗如非留体类抗炎药、阿片类药物等并不能很好的控制疾病,而目前有一种新型的治疗手段在临床上使用很广泛,且很多临床报道证实其效果显著,即臭氧治疗。臭氧在疼痛方面的应用已经有一百多年的历史,1988年,意大利医生Verga将臭氧注入腰大肌及椎旁间隙治疗腰腿痛。1998年,Muto等报道将臭氧注入椎间盘及椎旁间隙治疗腰椎间盘突出症,有效率为78%。1994～2000年,Albertini报告6665例多中心治疗腰椎间盘突出症的研究结果,有效率为80.9%。亚洲和东欧某些地区,如罗马、意大利、俄罗斯等都广泛的将臭氧应用于临床。在中国,医用臭氧作为一个非常重要的治疗神经病理性疼痛的替代疗法,被广泛用于椎间盘突出症、关节疾病、肩周炎、偏头痛、周围血管缺血性疾病及带状疱疹后遗疼痛等。虽然如今臭氧在疼痛类疾病的应用中十分广泛,但很少有学者研究臭氧治疗疼痛的机理,而臭氧对疼痛有确切疗效的实验学证据更是空白。这对臭氧的规范使用缺少了很多的指导证据。本实验室的前期研究结果与神经科学领域的前沿研究均提示:磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine mono-phosphate-activated protein kinase,AMPK),在痛觉调制中发挥了至关重要的作用。AMPK是一个位于真核细胞中的丝氨酸-苏氨酸激酶,是细胞中感受能量应激并调节物质代谢的关键分子。AMPK由催化性的α亚基和调控性的β,γ亚基组成,在不同的组织和细胞中组成多种异三聚体发挥蛋白质激酶活性。是真核细胞中极为关键的能量平衡感受器和调控者。AMPK最经典的激活通路是能量应激使ATP迅速消耗导致的AMP/ATP比值增加。AMPK经典的激动剂包括白藜芦醇、二甲双胍等。白藜芦醇(芪三酚)作为一种天然多酚类物质,是天然的抗氧化剂。白藜芦醇不仅可抑制血小板凝结、降低血液的粘稠度、舒张血管,从而保持血液畅通,还可以预防癌症的产生及发展。再者它还具有抗动脉粥样硬化和冠心病及治疗缺血性心脏病和高血脂的作用。最近的研究表明,AMPK不仅是一个能量响应性酶,它也检测氧化还原信号。臭氧具有强氧化性,所以臭氧起效的分子机制可能与AMPK密切相关。但是,臭氧是否是通过激活AMPK从而通过调节相关神经炎症来治疗疼痛,尚未见文献报道。因此,我们利用臭氧、白藜芦醇通过不同的慢性疼痛模型,对AMPK在慢性疼痛中的作用机制进行研究。第一部分臭氧激活AMPK治疗神经病理性疼痛的机制研究目的:研究臭氧对AMPK的作用,以及抑制神经病理性疼痛的分子机制方法:利用免疫印迹法检测臭氧对AMPK的影响;测定经典的疼痛行为学指标——大鼠缩足反射阈值,考察臭氧对神经病理性疼痛行为学的影响;利用免疫印迹法检测臭氧对于神经病理性疼痛标志性分子指标NR1、NR2B、PKCγ、ERK的影响;利用免疫印记和免疫荧光法检测臭氧对于脊髓小胶质细胞活化程度的影响。利用免疫印记和免疫荧光法检测臭氧对于体外培养的巨噬细胞中的AMPK和NF-κB的影响。结果:臭氧可以减轻CCI导致的大鼠神经病理性疼痛所致的机械学超敏,能降低与中枢敏化密切相关的NR1、NR2B、PKCγ和ERK的磷酸化水平。同时,臭氧能够在体内外显著激活AMPK。AMPK的激动剂AICAR和A769662可以很好的模拟臭氧的作用,减轻疼痛,同时臭氧的镇痛作用能够被AMPK抑制剂Compound C剂量依赖性的取消。在体外培养的巨噬细胞中臭氧能够抑制NF-κB p65的核转位。结论:臭氧能够通过激活AMPK,进而抑制神经病理性疼痛诱导的炎症反应,使得其能够治疗神经病理性疼痛。AMPK可能成为治疗神经病理性疼痛的潜在临床靶点,促进臭氧的临床应用。第二部分白藜芦醇激动AMPK治疗骨癌痛的机制研究目的:研究白藜芦醇对骨癌痛的影响及其作用机制方法:测定经典的疼痛行为学指标——大鼠缩足反射阈值,考察白藜芦醇对骨癌痛行为学的影响;利用免疫印迹法检测骨癌痛模型中AMPK的磷酸化水平,以及白藜芦醇对其的影响;利用免疫荧光法检测白藜芦醇对于AMPK、脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化程度、MAPK家族的影响。利用免疫印迹法检测白藜芦醇对AKT、mTOR磷酸化水平的影响;利用体外培养的星形胶质细胞和小胶质细胞,检测白藜芦醇对AMPK及MAPK家族的影响。结果:白藜芦醇可以减轻TCI导致的大鼠机械学超敏。白藜芦醇可以显著增加神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞上的AMPK的磷酸化水平,能降低TCI引起的异常升高的MAPK家族、AKT和mTOR的磷酸化水平。同时,白藜芦醇能够抑制体外培养的星形胶质细胞及小胶质细胞上的MAPK家族的磷酸化水平,及神经元上的AKT和mTOR的磷酸化水平。结论:白藜芦醇能通过激活AMPK抑制MAPK信号通路,进而抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的异常活化,以及神经元上AKT和mTOR的磷酸化水平,从而缓解骨癌痛。