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目的：采用“蛋白敲除”’技术-即调控SCF泛素-蛋白水解酶的底物特异性,降解乳腺癌细胞内磷酸化的ErbB家族蛋白,在细胞及动物模型中观察对乳腺癌细胞增殖、化疗敏感性以及细胞恶性转化的影响;探讨、研究蛋白敲除技术降解ErbB家族的抗肿瘤机制,为开发针对ErbB家族的新型抗肿瘤靶向药物提供理论基础。方法：1、(1)为验证前期所构建pcDNA3.0-F-Trcp-Shc和pcDNA3.0-F-Trcp-Shc(F198V)质粒的功能,瞬时转染293T细胞,免疫共沉淀(Co-IP)法检测F-Trcp-Shc泛素连接酶与ErbB蛋白的相互作用；Western blotting检测F-Trcp-Shc对ErbB蛋白的降解作用；将相应质粒与His-Ub共转染293T细胞,检测F-Trcp-Shc对ErbB2泛素化作用的影响；(2)将pcDNA3.0-F-Trcp-Shc和pcDNA3.0-F-Trcp-Shc(F198V)质粒酶切,亚克隆入pBMN-GFP,构建重组逆转录病毒载体pBMN-GFP-F-Trcp-Shc及pBMN-GFP-F-Trcp-Shc(m),将该重组质粒转化DH5a感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定；(3)将重组质粒与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带目的基因的重组逆转录病毒；(4)逆转录病毒感染ErbB过表达乳腺癌细胞系SKBR3、BT474,流式细胞仪分选GFP阳性表达细胞,Puromycin加压筛选7天,Western blot检测Flag蛋白表达。2、(1) Western blotting、Real-time PCR检测筛选后乳腺癌细胞系SKBR3及BT474中ErbB家族的蛋白、mRNA表达情况；流式细胞仪检测ErbB家族膜蛋白表达情况；(2) Western blotting检测蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂氯喹对F-TrCP-Shc E3泛素连接酶诱导ErbB家族蛋白降解的抑制作用;(3) Western blotting检测F-TrCP-Shc E3泛素连接酶降解乳腺癌细胞内ErbB家族蛋白对其下游信号通路活性的影响。3、(1)在细胞模型中,通过细胞计数、Annexin V/PI双染色法、XTT、平板克隆形成实验等方法,观察蛋白敲除方法降解ErbB家族对细胞增殖、细胞凋亡、化疗敏感性以及细胞恶性转化的影响；(2)通过乳腺癌细胞BT474裸鼠移植瘤模型,评价ErbB家族蛋白降解对细胞恶性转化以及肿瘤的发生、发展的影响。4、逆转录病毒感染人正常乳腺上皮细胞MCF-10A,流式细胞仪分选GFP阳性表达细胞,Puromycin加压筛选7天,Western blotting检测筛选后MCF-10A中ErbB家族的蛋白表达情况；观察ErbB磷酸化蛋白降解对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及化疗敏感性的影响。结果：1、(1) F-Trcp-Shc泛素连接酶能识别、结合ErbB2,并促进ErbB2多聚泛素化,诱导其降解；(2) pBMN-GFP-F-Trcp-Shc、pBMN-GFP-F-Trcp-Shc(m)载体经HindⅢ单酶切,所得片段大小与预期一致。初步验证质粒构建正确后,经测序证实载体序列与目的序列完全一致；(3)包装获得携带目的基因的重组逆转录病毒;(4)流式细胞仪分选GFP阳性表达细胞,Puromycin加压筛选后,获得稳定表达pBMN-GFP、 F-Trcp-Shc、F-Trcp-Shc(m)的人乳腺癌细胞系SKBR3、BT474, Flag蛋白表达良好。2、(1)在上述所建乳腺癌细胞系SKBR3、BT474中,相对于pBMN-GFP、 F-Trcp-Shc(m)对照组,F-Trcp-Shc能显著降低p-EGFR、p-ErbB2及p-ErbB3的表达,且能有效降低ErbB家族膜蛋白表达水平,而对其1mRNA转录水平则无明显影响；(2)蛋白酶体抑制剂MG132能明显抑制F-Trcp-Shc泛素连接酶诱导的ErbB家族蛋白的降解作用,而溶酶体抑制剂氯喹对其则无明显抑制作用；(3)F-TrCP-Shc E3泛素连接酶降解乳腺癌细胞内ErbB家族蛋白能明显抑制下游信号通路PI3K、 MAPK的活性。3、(1)在乳腺癌细胞模型中,相对于pBMN-GFP、pBMN-GFP-F-Trcp-Shc(m)对照组,F-Trcp-Shc降解ErbB家族磷酸化蛋白,可显著诱导乳腺癌细胞凋亡(BT74:11.7%vs0.83%vs0.79%, SKBR3:14.9%vs4.73%vs3.54%)(均P<0.001)；降低S期细胞的比重,诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制细胞增殖；能显著增强肿瘤细胞对顺铂杀伤的敏感性以及抑制细胞恶性转化；(2)在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中,相对于对照组,F-Trcp-Shc诱导ErbB家族蛋白的降解,明显抑制肿瘤生长速度。4、在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中,F-Trcp-Shc泛素连接酶能降解ErbB2磷酸化蛋白；但其对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及对顺铂杀伤敏感性均无明显影响。结论：1、(1) F-Trcp-Shc泛素连接酶能识别、结合ErbB蛋白,并促进其多聚泛素化,诱导其降解；(2)成功构建逆转录病毒载体pBMN-GFP、pBMN-GFP-F-Trcp-Shc及pBMN-GFP-F-Trcp-Shc(m);(3)获得稳定表达重组载体的ErbB过表达乳腺癌细胞系SKBR3、BT474。2、(1) F-TrCP-Shc E3泛素连接酶在蛋白水平通过泛素-蛋白酶体途径降解乳腺癌细胞内磷酸化的ErbB家族蛋白,且能有效降低其膜蛋白的表达；(2) ErbB家族磷酸化蛋白降解后,其下游信号通路活性明显降低。3、(1)在乳腺癌细胞模型中,F-TrCP-Shc E3泛素连接酶通过降解ErbB家族磷酸化蛋白能抑制细胞增殖,增强化疗敏感性以及抑制细胞恶性转化；(2)在动物模型中,F-TrCP-Shc E3泛素连接酶降解ErbB家族能有效抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。4、在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中,F-Trcp-Shc E3泛素连接酶对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及对顺铂杀伤敏感性均无明显影响。提示本研究所构建的F-Trcp-Shc E3泛素连接酶系统对ErbB过表达的乳腺癌细胞的抗肿瘤作用显著,对正常细胞的副作用微小。5、本研究通过探讨应用蛋白敲除技术降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其机制研究,为开发针对ErbB家族的新型抗肿瘤靶向药物提供了理论基础。未来研究应着重于与现存方法的相互比较,并评价其作为开发新一代靶向治疗的可行性。