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第一部分双靶标Real-time PCR法对日本血吸虫病家兔模型不同病期血清DNA的短期疗效考核目的:应用双靶标Real-time PCR法检测感染宿主不同病期吡喹酮治疗后血清DNA的动态变化,探索和评价以虫体DNA转阴作为疗效考核的时间节点,用于短期疗效考核的潜在价值。方法:建立日本血吸虫病家兔模型,除对照组家兔外,分别在感染后4w、7w、12w和16w按200㎎/㎏体重的剂量给予实验组家兔吡喹酮治疗(隔一周加强治疗一次)。于治疗后1-7d(每天)、第2w至处死(每周),与对照组家兔同步收集血清。抽提血清DNA,以双靶标Real-time PCR法进行检测。结果:双靶标Real-time PCR法均可在感染后3d的血清模板中检测到阳性产物。双靶标Real-time PCR法在家兔感染后3d~42w的血清中均可检测出阳性DNA;对不同病期治疗后血清DNA检测结果显示,Sj R2-QPCR和Sj19-QPCR检测的血清DNA峰值均出现在治疗后3d-4d,两种靶标在感染后4w、7w、12w、16w治疗组血清DNA的转阴时间分别为治疗后的6w-7w、15w-16w、18w-20w和26w-28w。在双性感染治疗后宿主血清虫体DNA转阴拐点的研究中,ROC分析提示,感染家兔均在治疗后2w左右虫体DNA呈转阴趋势。结论:Real-time PCR法对于日本血吸虫病具有早期诊断价值。两种靶标的QPCR定量检测结果显示,两种靶标均具有较高的敏感性且两者存在一定的互补性。前期研究显示,在感染宿主中血吸虫血清DNA来源于虫体和虫卵,通过定量检测血清DNA结果显示,两种靶标对不同病期治疗后血清DNA的转阴时间从6w-7w至26w-28w不等,而如依据血清中血吸虫虫体DNA的变化规律,经ROC分析推测虫体DNA转阴时间节点,可大大缩短疗效考核时间。本研究结果为探索以治疗后血清虫体DNA转阴时间节点作为短期疗效考核的潜在应用价值,提供了实验依据。第二部分双靶标巢式PCR法在日本血吸虫哨鼠预警模型中的应用研究目的:将双靶标巢式PCR法用于日本血吸虫哨鼠预警,探索该方法的灵敏性,评价其对早期预警的价值。方法:建立分别感染5条、10条和20条双性日本血吸虫尾蚴的哨鼠模型,将小鼠随机平均分为两组,一组用于剖解以评价实际感染程度,另一组分别在感染前(0d)和感染后3d、5d、1w和2w收集3组不同感染度小鼠血清,用两种靶标巢式PCR检测血清DNA,同时设两种免疫学方法对照。结果:Sj19巢式PCR法对3组不同感染度小鼠在感染后4个时间点的血清DNA均可检出阳性结果;Sj R2巢式PCR可检出感染5条双性尾蚴小鼠的感染后5d的血清DNA,对感染10条双性尾蚴小鼠的感染后3d、5d、1w的血清DNA可检出,对感染20条双性尾蚴小鼠的感染后4个时间点的血清DNA均可检出。而两种免疫学方法(IHA和ELISA)对3组不同感染度小鼠的感染后4个时间点的血清均未检出阳性结果。结论:Sj19和Sj R2巢式PCR法对哨鼠模型可在感染后3d或5d检测出特异性DNA,显示出较高的灵敏性。特别是Sj19巢式PCR法在感染5条双性日本血吸虫尾蚴小鼠的感染后3d血清DNA中即可检出阳性DNA,显示出更高的灵敏性。本研结果表明,应用Sj19和Sj R2巢式PCR法检测哨鼠模型血清DNA,大大缩短了预警时间,对日本血吸虫哨鼠早期预警具有潜在的实际应用价值。第三部分日本血吸虫尾蚴性别鉴定及配对感染后雌雄合抱率的研究目的:评价PCR法鉴定日本血吸虫尾蚴性别的效果,并探索不同感染度的雌雄尾蚴配对感染时,雌雄尾蚴易感性的差别,以及虫体存活和合抱率的变化。方法:收集不同单只阳性钉螺逸出的尾蚴,每只钉螺取两个尾蚴样本,碱裂解抽提尾蚴DNA,应用序列特征化扩增聚合酶链式反应(SCAR-PCR)法鉴定单只钉螺逸出尾蚴的性别,将鉴定后的钉螺按雌、雄性别分开饲养,约20天后再次逸出尾蚴,分别收集雌、雄尾蚴以5♂+5♀、10♂+10♀和15♂+15♀三个不同感染度配对感染小鼠,40d后解剖,记录每只小鼠检获虫体情况。结果:共23只阳性钉螺,经鉴定,10只钉螺可逸出单雌性尾蚴,9只钉螺可逸出单雄性尾蚴,4只钉螺可逸出双性尾蚴。在配对感染中,感染5♂+5♀、10♂+10♀和15♂+15♀三组小鼠的雌、雄虫存活率分别为72.0%和82.0%、71.3%和85.0%、62.0%和72.7%,经统计分析雌、雄尾蚴易感性无显著性差异;三组小鼠虫体总存活率分别为77.0%、78.0%、67.7%,其中感染15♂+15♀组略低于其他两组;三组小鼠的雌雄虫合抱率分别为68.6%、71.3%、62.0%,提示雌雄尾蚴等比例感染后雌雄合抱率较高。结论:SCAR-PCR是一种快速、简便、可靠的鉴定日本血吸虫尾蚴性别的方法,特别是对可逸出单雄性尾蚴钉螺的鉴定准确度高,为建立单雄性日本血吸虫动物模型用于药物等的研究具有重要意义。通过对配对感染确定雌雄合抱率的研究,为双性感染的实际感染度的评价提供了重要参考。