海洋占地球表面积的70%以上,蕴藏了种类多样、数量庞大的海洋微生物,是进行酶学研究的重要资源。微生物蛋白酶在碳氮地球化学循环中发挥着关键的作用。因而,研究海洋环境中微生物蛋白酶对于最终阐明海洋碳氮循环机制具有重要的意义。南极地区严苛的气候条件使之成为地球上最严峻的生境之一,其特有的生态环境孕育了独特的微生物类群。因而,这些地区的微生物可能能够分泌适应极端环境的特殊酶类。本论文分别对来自大西洋的海水和沉积物以及南极帽贝等样品的产蛋白酶微生物多样性进行了分析。在此基础上,对一株来自大西洋表层海水的菌株V.pomeroyi 12613-9所分泌的一种金属蛋白酶P9进行了分离纯化、异源表达及酶学性质和降解胶原蛋白的机制分析。1.南极帽贝体表产蛋白酶细菌的分离及多样性分析我们对采自南极长城站附近的南极帽贝体表产蛋白酶的细菌进行了分离,共计得到降解脱脂牛奶的菌株26株,降解明胶的菌株5株,底物降解能力均不是很强。对这些菌株的16S rDNA序列进行了测序及序列分析,结果显示所有菌株均属于Pseudoalteromonas属。以上结果表明Pseudoalteromonas是南极帽贝体表附生的可培养的产蛋白酶细菌的优势菌群。2.大西洋海水与沉积物中产蛋白酶细菌的分离及多样性分析在大西洋来源的表层海水和沉积物样品中,我们一共筛选得到151株可以降解酪蛋白、明胶或弹性蛋白的菌株,这些菌株分布于Pseudoalteromonas、Vibrio、Alteromonas 和 Sulfitobacter 属。在表层海水样品中 Pseudoalteromonas和Vibrio是优势菌群。而沉积物来源的样品中,随着采样位点的加深,优势种逐渐从Pseudoalteromonas属过渡到Alteromonas属。产酶能力分析表明,无论是沉积物还是表层海水来源的细菌,降解弹性蛋白的能力均弱于降解酪蛋白和明胶的能力。沉积物来源的细菌中,Alteromonas属和Pseudoaalteromonas属的大部分细菌都能够产生明显的酪蛋白和明胶的水解圈,并且在产酶菌株的数量上也占有绝对优势。在表层海水来源的细菌中,Vibrio属和Pseudoalteromonas属的大部分细菌能产生明显的酪蛋白或者明胶的水解圈,比较而言,Vibrio属的降解能力要高一些。这表明Vibrio属的细菌可能在表层海水的蛋白质降解过程中发挥着重要作用。3.蛋白酶P9的分离纯化、异源表达及酶学性质V.pomeroyi 12613-9是从大西洋表层海水样品中分离到的一株高产蛋白酶的菌株。我们从其发酵液中纯化得到了一个M4家族的金属蛋白酶,命名为P9。我们对P9进行了异源表达及纯化,所用表达菌株为Escherichia coli BL21(DE3)。野生酶和重组酶的最适底物均为明胶,最适pH都是6.0,最适酶活温度都是40℃。NaCl对酶活的影响实验表明,当NaCl浓度为4M时,野生酶仍然保持了近70%的活性,重组酶也保持了约50%的酶活,说明P9是个耐盐酶。此外,我们研究了金属离子及蛋白酶抑制剂对酶活性的影响,结果表明,Zn2+和金属蛋白酶抑制剂o-P可以抑制野生酶和重组酶的酶活。以上这些性质充分体现了蛋白酶P9对海洋高盐等环境的适应。4.蛋白酶P9对胶原蛋白的作用机制分析底物特异性实验表明,P9可明显降解可溶性胶原蛋白(即明胶),并对牛Ⅰ型胶原蛋白有一定的降解活性。为了分析P9是否有降解胶原蛋白分子的活性,我们首先利用原子力显微镜从微观尺度上观察P9处理对牛Ⅰ型胶原蛋白的影响,发现P9处理后的胶原蛋白发生松散,大量的胶原微纤丝暴露出来,但没有发现胶原微纤丝的进一步降解。同时生化实验分析表明,P9处理后的胶原蛋白上清液中糖含量有显著增加,但是游离氨基酸的含量增加并不明显。这些结果表明,P9可能能降解牛Ⅰ型胶原蛋白纤维中的交联物(如蛋白聚糖),但不能降解胶原蛋白。SDS-PAGE分析进一步证实,胶原蛋白中的核心蛋白聚糖Decorin和Fibronectin均被蛋白酶P9不同程度地降解。此外,我们利用HPLC证实了蛋白酶P9对单链胶原蛋白(胶原蛋白肽)具有降解活性,表明该酶之所以对明胶具有较高的活性,是因为胶原蛋白经过高温处理后,三螺旋的稳定结构被破坏,解旋成单链,进而被降解。根据以上结果,我们认为P9作用于胶原蛋白纤维时,可以通过降解纤维中起交联作用的蛋白聚糖打破胶原纤维的聚集结构,但不能降解三螺旋的胶原蛋白分子。这为进一步研究该蛋白酶的结构与功能奠定了基础。综上所述,分析大西洋等环境中产蛋白酶微生物多样性及研究蛋白酶P9对胶原蛋白的作用机制,不仅可以提升我们对全球碳氮循环的更深层次的理解,同时可以开发新型蛋白酶和微生物资源。