论文部分内容阅读
背景肺癌是严重危害人类健康的重大疾病,在世界范围内发病率和死亡率较高。在美国2019年预计有超过22.8万新发病例被诊断为肺癌,而且同年有超过14.3万的患者将死于肺癌。病理学上通常将肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及非小细胞肺癌(none small cell lung cancer,NSCLC),其中非小细胞肺癌约占85%。在免疫疗法被批准用于鳞状细胞肺癌之前,只有有限的传统的细胞毒性化疗药物被推荐用于治疗晚期和转移性鳞状非小细胞肺癌。目前肺癌治疗的主要方法包括手术切除、放疗、化疗、靶向治疗等。尽管近年来对肺癌局部病灶治疗技术手段日臻完善,化疗药品不断推陈出新,靶向治疗方兴未艾,但仍然不能解决肺癌的复发、转移等问题。目前肺癌治疗的难点在于病人就诊时往往已处于晚期,无法进行手术根治性治疗,治疗的效果也达不到预想的状态。继免疫检查点抑制剂之后,以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞为代表的免疫治疗逐渐成为研究的热点。经CAR基因修饰的T细胞(CAR-T)被赋予识别肿瘤细胞膜抗原肽分子,启动杀伤或增殖的能力。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)主要表达于上皮细胞和多种上皮来源的恶性肿瘤细胞,这与肿瘤的复发、血管生成和转移密切相关。与正常肺组织比较,肺癌组织EGFR表达明显增加,研究表明超过60%的非小细胞肺癌表达EGFR,且与结合位点的亲和力明显增强,因此可作为CAR-T治疗的特异性靶标。整合素相关蛋白(CD47)是一种膜糖蛋白,在不同组织细胞广泛表达,但在肿瘤细胞上表达明显增强。研究发现肿瘤细胞表面高表达CD47,可与巨噬细胞表面信号调节蛋白α(signal regulated protein alpha,SIRPα)结合,巨噬细胞吞噬作用被抑制,使得固有免疫系统不能清除肿瘤细胞,促进肿瘤的形成和发展。因此,阻断CD47可以作为癌症免疫检查点治疗的新靶点。方法:1.通过基因工程技术构建EGFR嵌合抗原受体,利用piggyBac转录系统采用电转染的方法转染人外周血T淋巴细胞。2.Western bolt法、流式细胞仪法和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测CAR-T细胞的表达和阳性率。CCK8法和细胞计数法检测CAR-T细胞的增殖能力。流式细胞仪法检测CAR-T细胞的活化、衰竭表型及抗原刺激后的细胞因子释放。3.运用实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)和IncuCyte实时动态细胞成像分析系统检测CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用。4.流式细胞仪法检测肿瘤细胞的EGFR和CD47的表达。5.建立NSG小鼠NSCLC皮下移植瘤模型,测定肿瘤的大小、小鼠体重、生存曲线和活体成像,运用动物模型研究EGFRCAR-T细胞对NSCLC的抗肿瘤作用。6.构建表达CD47抗体的EGFRCAR-T细胞,ELISA法测定CD47抗体的表达量,研究CD47EGFRCAR-T细胞的特性,体外研究T淋巴细胞表型、增殖能力、抗原刺激后细胞因子分泌和抗原特异性杀伤能力。7.建立NSG小鼠NSCLC皮下移植瘤模型,测定肿瘤的大小、小鼠体重,定期活体成像并测定荧光强度,运用动物模型研究CD47EGFRCAR-T细胞对NSCLC的治疗作用。结果:1.成功构建了EGFRCAR-T细胞,经Western bolt和RT-qPCR鉴定能够稳定表达EGFRCAR,流式法检测EGFRCAR-T细胞阳性率在44.6%左右。2.与靶细胞共培养后EGFRCAR-T细胞增殖能力明显优于对照组(P<0.05),且具有抗原特异性。构建的EGFRCAR-T淋巴细胞中央型记忆T细胞比例高于UTD组,且经抗原刺激后EGFRCAR-T细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)群体明显增加。3.RTCA法和IncuCyte法两种不同的方法均证实,EGFRCAR-T细胞能够特异性杀伤H23、H460等非小细胞肺癌细胞系,而且也能够特异性杀伤EGFR高表达的卵巢及宫颈癌细胞系。且EGFRCAR-T细胞对EGFR高表达肿瘤细胞的特异性杀伤功能更强。4.流式细胞仪分析EGFRCAR-T细胞与EGFR阳性肿瘤细胞共培养可以产生高水平的Th1型细胞因子,IL-2、TNFα、IFNγ水平明显高于对照组(P<0.01)。然而EGFRCAR-T细胞与靶细胞共培养时分泌较多的IL-4和IL-10,说明细胞间联合免疫受体酪氨酸活化基序的激活使得反向Th1反应加强。5.流式细胞法非小细胞肺癌细胞系A549、HCC827、Calu-6、H23、H460、H292和H1975的EGFR表达水平,并检测了这些细胞的CD47表达情况。6.建立NSG小鼠皮下移植瘤模型结果显示:EGFRCAR-T细胞能够有效抑制NSCLC肿瘤细胞的生长,与对照组比较(P<0.01),且能够显著延长EGFRCAR-T治疗组的生存时间(P<0.05),中位生存期为29.5天。且CD3免疫组化法未观察到正常组织的破坏及T淋巴细胞浸润。7.成功构建表达CD47抗体的EGFRCAR-T细胞,经经Western bolt鉴定能够稳定表达CD47抗体和EGFRCAR,ELISA法测定72小时CD47抗体表达水平可达4570ng/ml。8.流式法检测细胞因子结果显示EGFR阳性的肿瘤细胞系H23可以诱导CD47EGFRCAR-T细胞分泌Th1型细胞因子增加,且这种分泌具有抗原特异性,与对照组比较细胞因子分泌量显著增加(P<0.01)。RTCA法结果说明CD47EGFRCAR-T细胞能够特异性杀伤EGFR高表达的A549、H1975、H460和H23细胞。9.建立NSG小鼠皮下移植瘤模型结果显示:体内活体成像观察到CD47EGFRCAR-T细胞能够有效抑制NSCLC肿瘤细胞的生长,肿瘤体积明显缩小,活体成像荧光强度低于EGFRCAR-T组(P<0.05),说明CD47EGFRCAR-T细胞组对肿瘤的抑制作用强于EGFRCAR-T细胞组。对体重的影响,各对照组无明显差异(P>0.05)。结论:EGFR在非小细胞肺癌细胞系中广泛表达,可以作为NSCLC免疫治疗的靶点。表达EGFRCAR的基因工程T细胞能够特异性识别EGFR阳性的肺癌细胞,分泌细胞因子、加强增殖,具有特异性杀伤肿瘤细胞活性。EGFRCAR-T细胞能够有效抑制NSG小鼠的NSCLC肿瘤模型,延长小鼠生存期。表达CD47抗体的EGFRCAR-T细胞,能够稳定表达EGFRCAR并分泌CD47抗体,并抑制NSCLC小鼠模型的肿瘤生长。本研究为设计构建新型CAR-T细胞免疫疗法治疗非小细胞肺癌提供了新的策略。