背景肝细胞癌(HCC)是位列世界第四的恶性肿瘤,死亡率极高,迄今肝癌发生发展的分子机制尚未系统性阐明。细胞色素P450氧化酶(CYP)2E1是重要的肝脏药物代谢酶,主要参与前致癌物及环境毒物代谢。CYP2E1在肝癌中的作用,以往的研究主要集中在CYP2E1在体内代谢活化前致癌物如乙醇、亚硝胺,生成致癌物质,导致基因突变诱发癌症。然而,随着肝癌的进展,癌组织中的CYP2E1表达逐渐下降,并且CYP2E1低表达与肝癌的恶性生物学特征及患者短的生存期相关。CYP2E1在肝癌恶性进展过程中是否发挥特定的生物学功能以及通过何种机制发挥作用,尚不清楚。肝癌的发生与多种信号转导通路失调密切相关,Wnt/β-catenin信号转导通路是肝癌最常见的失调信号通路,Wnt信号的异常活化与肝癌起始、发展、侵袭、转移和复发密切相关。有关CYP2E1和Wnt/β-catenin信号通路之间的研究鲜见报道。目的1.CYP2E1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响;2.CYP2E1抑制肝癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究。方法1 CYP2E1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响1.1应用qRT-PCR、Western Blotting技术检测肝癌及癌旁组织中CYP2E1 mRNA及蛋白的表达水平。1.2 用Mann-Whitney U检验分析CYP2E1的表达变化与肝癌临床病理特征的关系。1.3 应用Kplan-Meier法分析CYP2E1的表达对肝癌患者总体生存期的影响。1.4 构建慢病毒介导的过表达CYP2E1肝癌细胞株,运用划痕修复、CCK-8、Transwell实验方法检测CYP2E1对肝癌细胞体外迁移、增殖及侵袭能力的影响。1.5 构建裸鼠皮下成瘤、肺转移及肝原位移植瘤模型,研究CYP2E1对肝癌细胞体内增殖及侵袭转移能力的影响。2 CYP2E1抑制肝癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究2.1 应用双荧光素酶报告基因方法、Western Blotting技术研究过表达CYP2E1对Wnt/β-catenin信号通路的影响。2.2 应用qRT-PCR、蛋白酶体抑制剂、Western Blotting、体外泛素化实验、Co-IP技术研究CYP2E1对E3泛素连接酶KLHL12介导的Dvl-2泛素化降解的影响。2.3 应用荧光探针ROS检测试剂盒、Western Blotting、Co-IP技术及抗氧化剂探索CYP2E1通过ROS抑制Wnt/β-catenin信号通路的机制。结果1 CYP2E1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响1.1 CYP2E1的表达水平在肝癌组织中显著低于配对癌旁组织在81对配对的样本中,74例肝癌组织中CYP2E1转录水平显著低于配对癌旁组织(P<0.0001),低表达率为91.36%。36对配对的样本中,肝癌组织中CYP2E1蛋白表达水平显著低于其配对癌旁组织,低表达率为77.8%。1.2 肝癌组织中CYP2E1低表达与吸烟、饮酒、肿瘤直径、血管侵犯及分化程度相关分析人口学因素、不同病理特征对肝癌组织中CYP2E1 mRNA的表达水平的影响。结果显示,吸烟肝癌患者组织CYP2E1 mRNA表达水平显著低于未吸烟患者(P=0.033);饮酒肝癌患者组织CYP2E1 mRNA表达水平低于未饮酒患者(P=0.020);肿瘤直径>5cm组比≤5cm组,CYP2E1 mRNA表达水平显著降低(P=0.049);血管侵犯组比无血管侵犯组的CYP2E1 mRNA表达水平明显下调(P=0.046);低分化组肝癌组织CYP2E1 mRNA表达水平低于中分化组(P>0.05),中分化组肝癌组织CYP2E1 mRNA表达水平显著低于高分化组(P=0.006)。1.3肝癌组织中CYP2E1低表达与患者短的生存期相关1.4过表达CYP2E1抑制肝癌细胞体外迁移、增殖及侵袭能力CCK-8结果显示,与对照组相比,过表达CYP2E1的MHCC-97H及SMMC-7721细胞增殖速度显著减慢;Transwell及划痕修复实验显示,过表达CYP2E1的肝癌细胞株侵袭和迁移能力显著弱于对照组细胞。1.5过表达CYP2E1抑制肝癌细胞体内增殖及侵袭转移能力裸鼠皮下成瘤结果显示,对照组裸鼠5天即有肉眼可见肿瘤,而MHCC-97H-CYP2E1组在第17天才有肉眼可见肿瘤,且肿瘤体积显著小于对照组裸鼠。小动物活体成像仪观察裸鼠肺转移模型,和对照组相比,MHCC-97H-CYP2E1和SMMC-7721-CYP2E1组裸鼠肺部荧光强度显著下降。进行肺组织切片H&E染色,发现对照细胞组裸鼠肺部组织出现了明显的肝癌细胞肺转移灶,而过表达CYP2E1组裸鼠几乎没有肺转移灶。小动物活体成像仪观察裸鼠肝原位移植瘤模型结果显示,MHCC-97H-CYP2E1组裸鼠肝荧光强度明显弱于对照组裸鼠。取瘤组织后发现,过表达CYP2E1组裸鼠有3只长出肿瘤(共5只),对照组5只全部成瘤,且过表达CYP2E1组肝脏肿瘤的体积明显小于对照组。2 CYP2E1抑制肝癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究2.1过表达CYP2E1抑制Wnt/β-catenin信号通路TOPFlash双荧光素酶报告实验显示,与对照组相比,过表达CYP2E1的SMMC-7721及MHCC-97H细胞荧光素酶活性明显下降(P<0.01)。Western Blotting结果表明,过表达CYP2E1显著降低Wnt/β-catenin通路重要成员Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1及c-Myc的蛋白表达水平。转染Dvl-2表达质粒后,过表达CYP2E1细胞的细胞增殖能力及蛋白表达水平明显回复。2.2 CYP2E1促进Dvl-2泛素化降解过表达CYP2E1降低Dvl-2蛋白表达水平,但对其mRNA表达水平没有影响,且Western Blotting检测发现蛋白酶体抑制剂MG132能够明显上调Dvl-2的表达,因此推测Dvl-2可能是通过蛋白酶体途径降解。体外泛素化实验发现,过表达CYP2E1组细胞Dvl-2的泛素化水平明显升高。2.3 CYP2E1增强KLHL12与Dvl-2之间的相互作用,促进Dvl-2泛素化降解KLHL12是降解Dvl-2的E3泛素连接酶,Co-IP结果显示Dvl-2与E3泛素连接酶KLHL12存在着相互作用,并且CYP2E1过表达组细胞KLHL12与Dvl-2的结合量比对照组明显增加,表明CYP2E1能够增强KLHL12与Dvl-2之间的相互作用。2.4 CYP2E1 通过ROS调控 Wnt/β-catenin 信号通路ROS荧光探针检测结果显示,与对照组相比,过表达CYP2E1显著升高细胞内ROS水平,用CYP2E1抑制剂CMZ及抗氧化剂NAC处理细胞后,发现ROS含量及Wnt/β-catenin信号的重要分子蛋白表达均发生逆转。2.5过表达CYP2E1抑制肝癌细胞EMTMHCC-97H和SMMC-7721细胞过表达CYP2E1后,观察到细胞形态由细长形向鹅卵形发生转化。检测EMT标志的蛋白E-cadherin、N-cadherin及Vimentin,发现过表达 CYP2E1 组细胞 E-cadherin 表达增加,N-cadherin、Vimentin表达下降。同时检测调控EMT的转录因子Twist、Snail及Slug,和对照组相比,过表达CYP2E1组细胞的Twist、Snail及Slug的蛋白表达均明显降低。结论1.肝癌组织中CYP2E1低表达,且与肿瘤直径、血管侵犯、肿瘤分化程度及患者短的生存期相关。2.过表达CYP2E1抑制肝癌细胞体内、体外增殖及侵袭转移能力。3.CYP2E1通过Dvl-2泛素化降解抑制Wnt/β-catenin信号通路。4.CYP2E1增加ROS的生成,抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制肝癌的进展。创新性1.CYP2E1抑制肝癌侵袭转移。2.CYP2E1通过ROS调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞增殖、侵袭及迁移。3.CYP2E1调控Dvl-2泛素化降解。