动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性血管性疾病,其发生是一个多层次、各种因素和细胞成分相互影响的瀑布式发展过程。在动脉粥样硬化早期阶段可观察到氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)的聚集和血管内皮细胞结构和功能的损伤,被认为是动脉粥样硬化发生的始动因素。oxLDL可以诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成,导致线粒体功能障碍,诱导内皮细胞氧化应激和凋亡。线粒体是细胞内产生ROS的主要部位,线粒体功能受损会进一步增加ROS的生成,诱导血管内皮细胞功能障碍,从而导致动脉粥样硬化形成。最近研究表明,心脑血管病危险因素与活性氧水平增加密切相关,并可导致心脑血管线粒体的损害和功能障碍。综上所述,线粒体被认为是连接心脑血管病危险因素、氧化应激和内皮细胞功能障碍的重要环节,也是促进动脉粥样硬化病变形成和发展的重要因素。因此,应用线粒体靶向的抗氧化剂治疗药物可以通过抑制过量ROS生成,改善线粒体功能,从而达到防治动脉粥样硬化发生的作用。艾地苯醌是辅酶Q10的合成类似物,具有相同的苯醌环样结构,而其短烷基侧链替代了COQ10的类异戊二烯侧链,更易通过生物膜和血脑屏障。艾地苯醌和辅酶Q10发挥电子传递、抗氧化作用主要依赖与苯醌环,苯醌环接受两个电子还原生成稳定的氢醌,在电子传递链中氧化型与还原型这两种形式相互转变,成为线粒体呼吸链的递氢体及电子传递的载体。苯醌环接受一个电子生成不稳定的半醌结构,形成超氧化物,促进氧化应激的发生。辅酶Q10是线粒体电子传递链(electron transport chain, ETC)的关键组成部分,主要从线粒体复合体Ⅰ或复合体Ⅱ接受2个电子,再将电子传递给复合体Ⅲ,抗氧化清除自由基、传递电子,最终生成ATP。辅酶Q10发挥清除自由基、传递的电子的作用依赖于线粒体功能,特别是线粒体复合物Ⅰ的功能。然而艾地苯醌生成氢醌的方式与辅酶Q10不同,艾地苯醌像辅酶Q一样可以在线粒体复合物Ⅰ与疏水醌的位点结合被还原,然而由于艾地苯醌亲脂的侧链较短,其与线粒体复合物Ⅰ袋状部位结合不易解离,释放非常缓慢,其作为竞争性底物,抑制向内源性辅酶Q传递电子。同时由于内源性辅酶Q的高亲脂性,其不能与“非生理的”亲水醌结合位点结合。艾地苯醌比辅酶Q亲脂性小,可以与复合物Ⅰ中亲水醌位点结合,这个位点与NADH结合位点及FMN部分重叠,被黄素还原形成一个不稳定的半醌产生超氧化物,促进氧化应激。故艾地苯醌很少部分通过线粒体复合物Ⅰ的传递电子,但可以通过其他旁路传递电子,如NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (enzyme NADPH-quinone oxidoreductase 1,NQO1)、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ及G3PDH穿梭等,在线粒体电子呼吸链中将电子传递到线粒体复合物Ⅲ,不依赖于线粒体复合物Ⅰ的功能,起到传递电子,抗氧化清除自由基。艾地苯醌主要在细胞质中可以被NAD(P)H:醌氧化还原酶1 (enzyme NADPH-quinone oxidoreductase 1,NQO1)还原生成氢醌,将2个电子传递给电子呼吸链复合物Ⅲ,促进生成ATP,抑制ROS生成。在此过程中,艾地苯醌发挥其治疗潜力的关键是NQO1活化。NQO1活化依赖氧化应激和NF-E2相关因子／抗氧化反应元件(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2/Antioxidant responsive element, Nrf2/ARE)通路调控。Nrf2/ARE信号途径通路可以介导体外血管内皮细胞抗动脉粥样硬化基因的表达,起到抗炎、抗细胞凋亡、抗动脉粥样硬化的作用。而AS的发生与氧化应激、细胞凋亡、线粒体功能受损、Nrf2/ARE通路途径密切相关,因此,考虑艾地苯醌可能起到防治动脉粥样硬化的作用,同时由于艾地苯醌具有良好的耐受性和安全性,有很好的研究前景,然而,目前很少有研究关注艾地苯醌的抗动脉粥样硬化作用及其作用机制。糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种促凋亡蛋白激酶,主要通过磷酸化多种底物蛋白来调节细胞增殖、凋亡、细胞信号传导以及新生血管形成等多方面。GSK3β有两种磷酸化形式,P-GSK3β(Tyr216)活化型,P-GSK3β(Ser9)非活化型。当Ser9位点磷酸化时,GSK3β活性被抑制。氯化锂(LiCl)是一种选择性的GSK-3β抑制剂,可以使GSK3β失活,线粒体膜电位增加,抑制细胞色素C从线粒体释放细胞浆,抑制线粒体凋亡途径及内皮细胞凋亡。同时GSK3β可以抑制抗氧化应激的Nrf2/ARE信号传导通路,促进细胞凋亡。β-catenin是GSK3β信号通路下游的关键分子,GSK3β失活抑制细胞内β-catenin的磷酸化水平,进而导致β-catenin胞浆内稳定并累积进入胞核,β-catenin在核内与T细胞因子／淋巴样增强因子(TCF/LEF)转录因子结合,进一步激活下游靶基因,能够改善细胞的功能,抑制细胞凋亡。这些证据表明,GSK3β和β-catenin蛋白可能在动脉粥样硬化中发挥重要的作用,艾地苯醌可能通过影响GSK3β、 β-catenin蛋白水平发挥抗动脉粥样硬化作用。本课题通过体外试验,建立oxLDL诱导人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)形成早期动脉粥样硬化功能损伤的模型,给予艾地苯醌预处理,研究艾地苯醌是否具有保护线粒体、抗血管内皮细胞凋亡的作用,是否可以作为一种线粒体保护剂用于防治早期血管动脉粥样硬化,并探讨其相关的机制,同时研究GSK3β、β-catenin信号蛋白此过程中的作用,以期为防治早期动脉粥样硬化寻求治疗靶点。本研究分两个部分：第一部分 艾地苯醌对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用目的探讨艾地苯醌对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡的影响。方法1.人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定。获得山东大学齐鲁医院伦理委员会同意,取山东大学齐鲁医院产科行剖宫产术的健康产妇分娩的新生儿脐带,分离原代人脐静脉内皮细胞,后进行传代培养,进行内皮细胞鉴定,取3-5代进行后续实验。2.观察oxLDL对脐静脉内皮细胞的损伤以及艾地苯醌的作用。将体外培养的HUVECs随机分为5组：①正常对照组；②100μg/mlo xLDL组；③0.05μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL组；④0.1μM艾地苯醌100μg/ml oxLDL艾地苯醌+100μg/ml oxLDL组。用倒置显微镜观察各组细胞形态学特征,各组细胞与CCK-8(Cell counting Kit-8)共同孵育,用酶联免疫法检测各组血管内皮细胞增殖水平。用Hoechst33258荧光染色,用荧光显微镜观察各组细胞核凋亡情况。各组细胞进行Annexin V-FITC双标法染色后利用流式细胞仪,检测各组细胞凋亡率。提取各组细胞的总蛋白,采用Western blot检测各组细胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果1.人脐静脉血管内皮细胞特异性抗原鉴定在共聚焦显微镜下观察培养的血管内皮细胞Factor VIII Related Antigen及CD31高表达,证实所培养的细胞是血管内皮细胞。2.艾地苯醌预处理对oxLDL诱导的内皮细胞损伤的形态学特征及细胞增殖水平的影响与正常组比较,100μg/ml oxLDL培养内皮细胞可见细胞胞体缩小、皱缩,胞质出现空泡,细胞表面出现黑色颗粒,核膜模糊,较多的细胞变圆脱落,有细胞破碎,未脱落细胞收缩变小,多有细长突起相互牵连,出现凋亡改变,细胞增殖水平明显下降(65.85±4.25%)(P<0.01)。与oxLDL组比较,0.05μM, 0.1μM, 0.2μM艾地苯醌预处理组+100μg/ml oxLDL各组HUVECs细胞形态明显改善,皱缩及悬浮细胞明显减少,各组的细胞增殖水平明显提高(分别是75.68±2.59%,78.24±2.12%,81.48±2.39%)(P<0.05)。提示艾地苯醌可以明显改善oxLDL损伤的内皮细胞的细胞形态,提高细胞增殖水平。3.艾地苯醌预处理抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡各组细胞经Hoechst 33258染色后,oxLDL诱导HUVECs细胞核凋亡,有的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光,有的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体,细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。与oxLDL组相比,艾地苯醌预处理的HUVEC细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀低强度荧光,细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。各组细胞用Annexin V-FITC双标法染色后,利用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,与正常组相比,oxLDL组内皮细胞凋亡细胞明显增多(27.18±2.76% vs5.37±0.69%)(P<0.01)。与oxLDL组相比,0.05μM, 0.1μM,0.2μM艾地苯醌预处理+oxLDL组凋亡细胞均明显减少(分别是18.37±2.32%,16.76±2.65%,13.52±2.43%)(P<0.05)。提示艾地苯醌预处理可以明显抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡。4.艾地苯醌预处理通过调节Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3凋亡蛋白水平抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡。与正常组相比,100μg/ml oxLDL组HUVECs Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显增高, cleaved caspase-3表达明显增高(P0.01)。与oxLDL组比较,0.05μm、 0.1μm、0.2μm艾地苯醌预处理+100μg/ml oxLDL组HUVECs Bcl-2蛋白表达水平明显增高,Bax蛋白、cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。提示艾地苯醌可以通过稳定Bcl-2,抑制Bax、cleaved caspase-3蛋白表达,抑制细胞凋亡,保护受损的血管内皮细胞。结论在体外培养的人脐静脉内皮细胞中,艾地苯醌预处理在一定的浓度下,能够明显抑制氧化型低密度脂蛋白诱导细胞凋亡,其可以通过稳定Bcl-2,抑制Bax、 cleaved caspase-3表达,抑制细胞凋亡,保护受损的血管内皮细胞。第二部分艾地苯醌对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的保护机制研究目的研究艾地苯醌对氧化型低密度脂蛋白诱导的早期血管内皮细胞功能障碍的保护机制,探讨GSK3β、β-catenin蛋白在此过程中作用。方法1.研究艾地苯醌对线粒体功能的影响。将体外培养的人脐静脉血管内皮细胞随机分为5组：①正常对照组；②100μg/ml oxLDL组；③0.05μM艾地苯醌+100μg/ml OxLDL组；④0.1μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL组；⑤0.2μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL组。提取各组细胞的总蛋白,用酶标仪检测各组细胞内的MDA、SOD活力水平。各组细胞进行JC-1染色,用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位水平。荧光素酶基因报告系统检测细胞ATP生成量。利用线粒体分离试剂盒分离细胞胞浆及线粒体,提取胞浆及线粒体的蛋白,用Western Blot检测细胞胞浆及线粒体的细胞色素C蛋白表达水平,porin和β-actin作为内参。2.研究艾地苯醌对GSK3β、β-catenin信号蛋白的影响。将体外培养的人脐静脉血管内皮细胞随机分为4组：①正常对照组；②100μg/ml oxLDL组；③0.2μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL组;④GSK-3β抑制剂10mM LiCL+100μg/ml oxLDL组,作为阳性对照。用试剂盒提取细胞总蛋白、分离胞浆蛋白及细胞核蛋白,Western blotting检测各组HUVECs的总GSK3β、P-GSK3p(Ser9)、总β-catenin、 P-β-Catenin (Ser33/37/Thr41)、胞浆β-catenin、胞核β-catenin水平,GAPDH、p-actin和Histone H2A作为内参。结果1.艾地苯醌明显抑制oxLDL诱导的脂质过氧化,增强SOD活力。与正常组相比,100μg/ml oxLDL组内皮细胞生成MDA量显著增高(3.34±0.23 nmol/mg protein vs 1.48±0.14 nmol/mg protein), SOD活力显著降低(2.12±0.18 unit/mg protein vs 4.36±0.31 unit/mg protein)(P<0.01)。与100μg/ml oxLDL组相比,0.05μM、0.1 μM、0.2μM的艾地苯醌预处理+100μg/ml oxLDL的各组MDA生成量均明显降低(分别是2.72±0.28 nmol/mg protein,2.41±0.15 nmol/mg protein,2.26±0.13 nmol/mg protein), SOD活力均明显增高(分别是3.05±0.25 unit/mg protein,3.33±0.23 unit/mg protein,3.59±0.21 unit/mg protein) (P<0.01),提示艾地苯醌可以通过抑制细胞脂质过氧化,增强细胞清除氧自由基能力,保护oxLDL损伤的血管内皮细胞。2.艾地苯醌通过保护线粒体功能,抑制线粒体凋亡通路,抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡。与正常细胞组相比,oxLDL组红色荧光(JC-1聚合体)明显减弱,红绿荧光比值显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),间接反映线粒体膜电位ΔΨm显著降低。与100μg/ml oxLDL组内皮细胞相比,加用0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌预处理+100μg/ml oxLDL的各组红色荧光强度明显增加,红绿荧光比值显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),说明线粒体膜电位ΔΨm显著增高,提示艾地苯醌可以通过提高细胞线粒体膜电位,改善线粒体通透性转换孔功能,保护线粒体。与正常组相比,100μg/ml oxLDL组血管内皮细胞ATP水平显著降低(8.83±1.71μmol/mg protein vs 23.82±3.43μmol/mg protein) (P<0.01)。与100μg/ml oxLDL组血管内皮细胞比较,0.05μM、0.1μM、0.2μM终浓度的艾地苯醌+oxLDL 100μg/ml组内皮细胞ATP水平均明显升高(分别为15.16±2.190μmol/mg protein,16.37±3.51μmol/mg protein,17.12±2.06μmol/mg protein)差异有统计学意义(P<0.05),提示艾地苯醌可以明显提高oxLDL抑制的血管内皮细胞的ATP生成量,保护线粒体功能。与正常组相比,100μg/ml oxLDL组HUVECs线粒体细胞色素C蛋白表达水平明显降低,胞浆细胞色素C蛋白表达水平明显增高(P<0.01),提示细胞色素C从细胞线粒体中释放到细胞浆中,说明oxLDL通过细胞线粒体凋亡通路引起细胞凋亡。与oxLDL组比较,分别用0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌预处理2小时+100μg/ml oxLDL组,线粒体细胞色素C蛋白表达水平明显增高,胞浆细胞色素C蛋白表达水平明显降低(P<0.05),提示艾地苯醌通过抑制细胞线粒体凋亡通路,保护受损的血管内皮细胞。3.艾地苯醌对GSK3β、 β-catenin蛋白磷酸化水平及活性的影响与正常组比较,100μg/ml oxLDL组的P-GSK3β(Ser9)明显降低,上调GSK3β活性,使P-β-catenin (Ser33/37/Thr41)含量明显增加,胞浆β-catenin蛋白表达水平明显增加,胞核β-catenin蛋白表达水平明显降低(P<0.05),影响GSK3β、β-catenin通路的信号传导,促进细胞凋亡。与100μg/ml oxLDL组比较,0.2μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL组的P-GSK3p(Ser9)蛋白表达水平明显增加,使GSK3β失活,P-β-Catenin (Ser33/37/Thr41)蛋白表达水平明显降低,同时伴随着胞浆β-catenin蛋白表达明显降低和胞核β-catenin蛋白表达水平明显增加,使β-catenin核内聚集(P<0.05)。与lOmM LiCL处理做为阳性对照一致,P-catenin核内聚集与GSK3β的活性有关。四组之间比较细胞的总蛋白的GSK3β、β-catenin蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。结论1,在体外培养的人脐静脉内皮细胞中,艾地苯醌通过抑制oxLDL诱导的细胞脂质过氧化,增强细胞清除氧自由基能力,抑制细胞氧化应激反应。2.早期艾地苯醌干预通过改善氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉血管内皮细胞的线粒体膜电位下降,增加细胞ATP生成量,改善线粒体功能,抑制血管内皮细胞的线粒体凋亡通路,抑制血管内皮细胞的凋亡。3.早期艾地苯醌干预可以使P-GSK3β(Ser9)明显增加,使GSK3β失活,失活的GSK3β影响下游β-catenin的磷酸化,P-β-Catenin (Ser33/37/Thr41)含量降低,促进β-catenin从细胞浆向细胞核转移,并在细胞核中积累,影响其信号通路,保护线粒体功能,起到抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞的凋亡,可以作为一种抗氧化剂用于防治初期动脉粥样硬化。