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目的研究人胎儿来源骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human fetalbone marrow,hfBM-MSCs)及肝脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived fromhuman fetal liver,hfL-MSCs)的基本生物学特性;在体外诱导hfBM-MSCs及hfL-MSCs向胰岛β样细胞分化。方法取材12-20周流产胎儿。冲洗四肢长骨骨髓腔得到全骨髓细胞悬液;剪切、吹打胎肝组织获取肝细胞悬液,通过二步离心收集肝非实质细胞,再用羟乙基淀粉(hydroxyethylstarch,HES)沉淀红细胞,从而使有核细胞得到富集。接种、培养上述细胞,利用细胞差速贴壁生长的特性纯化MSCs。流式细胞仪检测hfBM-MSCs和hfL-MSCs的细胞周期和表面标志;RT-PCR及免疫(荧光)细胞化学染色检测AKP,hTERT,SSEA-4和Oct 4等胚胎干细胞特异性标志的在hfBM-MSCs和hfL-MSCs中的表达情况;用经典方法诱导hfBM-MSCs和hfL-MSCs向神经元、肌细胞(脂肪细胞、成骨细胞)和肝细胞所代表的外、中、内三个胚层细胞分化;对P8代及冻存半年后复苏的hfBM-MSCs和hfL-MSCs进行染色体分析;注射hfBM-MSCs和hfL-MSCs到裸鼠背部及肾被膜下以观察有无肿瘤形成;将hfBM-MSCs和hfL-MSCs与K562细胞共培养,观察其对肿瘤细胞生长的影响。采用各种方案诱导hfBM-MSCs和hfL-MSCs向胰岛β细胞分化,根据细胞在诱导前后的形态变化、胰岛相关基因及胰岛特异蛋白的表达情况(RT-PCR及免疫细胞化学染色),筛选、优化出最佳方案;对优化方案诱导的胰岛样细胞团(islet-like clusters,ILCs),进一步用透射和扫描电镜观察其表面及内部超微结构;双硫腙染色鉴定ILCs是否含有锌离子;化学发光法检测ILCs的胰岛素分泌量及胞浆内胰岛素含量;进行胰岛素释放实验以评价ILCs的功能;用Western blot鉴定ILCs分泌物的性质(是胰岛素,还是胰岛素原,或者兼而有之);最后,将ILCs移植到糖尿病小鼠左侧肾被膜下,每隔2-3d检测血糖变化;对血糖降至正常的小鼠,摘除其左肾以观察血糖是否反弹,最后取行异源移植小鼠的肾脏和胰腺进行免疫组化检测。结果从人胎儿骨髓及肝脏中分离、纯化得到MSCs;P3代hfBM-MSCs和hfL-MSCs均有90%以上处于G0/G1期,表达CD29、CD44和CD105,不表达CD15、CD34、CD45以及移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)相关的抗原如HLA-DR、CD40、CD80、CD86等;RT-PCR表明hfBM-MSCs和hfL-MSCs表达Oct 4,SSEA-4和hTERT等胚胎干细胞特异性标志,免疫细胞化学显示AKP,hTERT,SSEA-4和Oct 4等胚胎干细胞特异性蛋白呈阳性表达;在各种常规诱导条件下,hfBM-MSCs和hfL-MSCs可分化为类神经元、成脂细胞、成骨细胞、成肌细胞以及类肝细胞等;hfBM-MSCs和htL-MSCs在多次传代(P8代)及冻存半年后复苏仍保持正常核型;hfBM-MSCs和hfL-MSCs注射到裸鼠皮下及肾被膜下均未观察到肿瘤形成;hfBM-MSCs和hfL-MSCs与K562细胞共培养,可以抑制肿瘤细胞的生长。在向胰岛β细胞分化方面,诱导前hfBM-MSCs和hfL-MSCs呈梭形贴壁细胞,经最佳方案诱导后,细胞快速变成圆形或椭圆形,并聚集形成越来越多的ILCs(在25cm~2培养瓶的细胞生长面可见数百个ILCs);RT-PCR结果显示ILCs表达胰岛相关基因,如胰十二指肠同源异型看家基因盒基因-1(pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1)、神经源素(neurogenin 3,ngn3)、胰岛1(Islet1,isl 1)、胰岛素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,glut2)等;免疫荧光染色结果表明ILCs强表达胰岛特异性蛋白,如胰岛素(Insulin)、C-肽(C-peptide)及胰高血糖素(Glucagon)等;ILCs经双硫腙染色后呈现猩红色阳性反应;扫描电镜显示未诱导MSCs表面无囊泡状突起,而ILCs表面分布有大小不等的囊泡样结构;透射电镜下可观察到ILCs的细胞表面有粗短的微绒毛,细胞内有较多大小不等、深浅不一的分泌颗粒;化学发光免疫分析法测得ILCs的培养液上清中免疫反应性胰岛素(immunoreactive insulin,IRI)大量分泌,在hfBM-MSCs和hfL-MSCs诱导的ILCs分别为(210±35.07)μU/mL和(106.7±28.21)μU/mL;胰岛素释放实验表明ILCs具有一定的糖反应性,刺激指数在hfBM-MSCs和hfL-MSCs诱导的ILCs分别为4.38±0.32和4.22±0.27;Western blot证实ILCs蛋白提取物中多为胰岛素原,提示体外诱导的ILCs不够成熟。移植ILCs到糖尿病小鼠的。肾被膜下,可观察到小鼠的血糖逐渐下降,而非移植组糖尿病小鼠则持续高血糖;摘除血糖降至正常的小鼠左肾,可见血糖出现反弹,小鼠很快死亡;该鼠肾被膜下移植物的免疫组织化学染色显示胰岛素阳性细胞,而其胰腺中胰岛萎缩,数量减少,胰岛素阳性细胞少见。结论hfBM-MSCs及hfL-MSCs具有类胚胎干细胞特性,体外诱导可向三个胚层来源的细胞分化,且免疫原性弱,无致瘤性,是组织工程和细胞治疗较为理想的种子细胞;hfBM-MSCs及hfL-MSCs在体外易于向胰岛β细胞的分化,但不够成熟,需移植糖尿病小鼠体内进一步发育以发挥调节血糖的作用。