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研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,系造血干/祖细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻引起的造血系统肿瘤。其中,伴重现性遗传学改变t(8;21)的AML是常见亚型,约占全部AML患者10-15%,占FAB分型M2比例约40%。t(8;21)阳性的AML通常被认为是一种预后良好的类型,欧美的研究报道长期生存率为60%-70%;韩国的一项研究报道认为伴t(8;21)的AML与不伴t(8;21)的AML预后无明显差异；国内两个较大系列的研究报道5年总生存率仅为39%和50%。目前此类白血病的治疗手段主要是以阿糖胞苷为主的联合化疗,而复发和耐药是影响此类白血病预后的主要因素。因此,发现新的治疗手段提高该类白血病的治疗效果具有重要价值。Kasumi-1细胞是培养自人t(8;21)急性髓系白血病患者的细胞系,可作为研究此类白血病的良好模型。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL),又称凋亡素2配体(Apo-2L),为Ⅱ型膜蛋白,属于肿瘤坏死因子超家族成员。TRAIL与死亡受体的相互作用能诱导多种肿瘤细胞及转化细胞发生凋亡,但对正常组织及细胞无损伤作用,已成为抗肿瘤治疗研究的热点之一。尽管TRAIL已被证实能杀伤白血病细胞而不影响正常宿主细胞,但某些肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡有耐受性,为其临床应用带来巨大挑战。本课题组经研究发现,rsTRAIL在体外及体内均能够诱导Kasumi-1细胞凋亡,但在达到一定浓度之后,Kasumi-1细胞的存活率不再随着TRAIL浓度升高而下降,表现出了耐药性。在此观察的基础上,进一步经体外诱导确立了TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株,对其mRNA表达谱进行分析,筛选出可能的耐药基因。但该研究中使用的rsTRAIL活性低,即使Kasumi-1亲本细胞株已对其显示相当程度的耐药。因此,有必要采用活性更高的rsTRAIL进一步观察其作用,并对耐药机制进行初步探讨。基因转录的有序调控是细胞维持正常功能的关键,而核心组蛋白的乙酰化和脱乙酰化是基因转录调控重要方式。肿瘤的发生发展被认为与组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)功能紊乱,导致某些特定基因的转录受抑相关。组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACIs)可以抑制组蛋白脱乙酰化酶,促进组蛋白乙酰化,调节染色质结构和基因转录,表现出细胞周期阻滞、促进分化、诱导凋亡等作用。研究表明HDACIs单药或联合其它化疗药物均能起到抗肿瘤作用,成为治疗AML. ALL及MDS等血液系统疾病的研究热点。Panobinostat (LBH589)是一种新型的小分子HDACIs,为氧肟酸类,能在小剂量、低毒性情况下诱导肿瘤细胞凋亡。LBH589能够增强组蛋白H3、H4的乙酰化水平和非组蛋白p53、Hsp90等的乙酰化水平,在白血病细胞中,能减弱BCR-ABL、AKT、ERK1/2等信号蛋白的磷酸化,以剂量依赖的形式诱导凋亡。本课题组之前的研究发现,LBH589能够以时间剂量依赖的方式诱导Kasumi-1细胞凋亡,并与rsTRAIL起协同作用。因此,观察LBH589能否对TRAIL耐药的Kasumi-1细胞起到逆转耐药的作用,对于进一步分析其与rsTARIL联合使用的临床前景具有重要价值。本研究旨在对TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株进一步诱导耐药,并探讨LBH589对其是否具有逆转耐药的作用。第一部分TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株耐药作用再诱导及耐药机制目的：增强TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株的耐药特性,并对耐药机制进行初步探讨。方法：1)使用活性高的rsTRAIL作用于之前确立的TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株(Kasumi-1R细胞株),采用持续梯度诱导法,体外筛选并期望得到新的耐药细胞株Kasumi-1 TR2(Kausmi-1 resistant to TRAIL cell line 2); 2)采用WST-8(CCK-8)比色法分别测定Kasumi-1细胞,Kasumi-1R细胞和Kasumi-1TR2细胞的生长曲线,以及加入新的rsTRAIL后的生长抑制曲线,确立新的rsTRAIL作用下的IC50及耐药系数(Resistance Index, RI); 3)使用实时荧光定量PCR法和Western-blot法分析Kasumi-1 TR2细胞与Kasumi-1细胞耐药相关基因DR4, BCL2, BCL2A1及IFNAR1的表达差异。结果：(1)经活性高的rsTRAIL诱导,可确立新的耐药细胞株Kasumi-1TR2。 Kasumi-1TR2细胞与Kasumi-1R细胞增殖速率无明显差异,但均高于Kasumi-1细胞。(2)Kasumi-1TR2细胞24h的IC50为83133.88ng/ml,耐药系数RI为14445,48h的IC50为5402.79ng/ml,耐药系数RI为255137。(3)实时荧光定量PCR法检测发现Kasumi-1 R2细胞DR4mRNA转录下调,BCL2、BCL2A1、IFNAR1 mRNA转录上调。(4) Western Blot法检测发现Kasumi-1TR2细胞及Kasumni-IR细胞BCL2、BCL2A1、IFNAR蛋白表达上调,DR4总蛋白较Kasumi-1细胞表达无明显差异。结论：经再诱导可确立新的TRAIL耐药的Kasumi-1细胞株(Kasumi-1 TR2细胞株)。Kasumi-1 TR2细胞株对rsTRAIL高度耐药,耐药机制与BCL2、BCL2A1、 IFNAR1表达上调有关,可能与DR4表达下调有关。第二部分LBH589对Kasumi-1TR2细胞逆转耐药作用的体外观察目的：观察LBH589在体外能否对Kasumi-1TR2细胞起到逆转耐药的作用。方法：采用Wright染色法观察rsTRAIL单药、LBH589单药及二者联合作用于Kasumi-1TR2细胞后细胞形态的改变；采用WST-8 (CCK-8)比色法测定rsTRAIL单药、LBH589单药及二者联合应用对Kasumi-1TR2细胞的生长抑制作用；用流式细胞术检测rsTRAIL单药、LBH589单药及二者联合作用于Kasumi-1TR2细胞后的凋亡率。结果：(1) Kasumi-1TR2耐药细胞株对rsTRAIL高度耐药,LBH589在体外单独应用可抑制Kasumi-1TR2细胞的生长,LBH589与rsTRAIL联合用药可增加其对Kasumi-1TR2细胞的生长抑制率,表现出逆转TRAIL耐药的作用,且呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。(2)LBH589 (50nM)在体外单药及与rsTRAIL (50ng/mL)联合作用于Kasumi-1TR2细胞48h, Annexin V阳性细胞百分率分别为(23.97±7.77)%和(57.57±6.54)%,与对照组(4.20±2.33)%相比,差异显著(P<0.05),联合用药组与rsTRAIL单药组(13.6±7.05)%相比,差异显著(P<0.001)。结论：LBH589在体外具有对Kasumi-1TR2细胞逆转TRAIL耐药的作用。第三部分LBH589对Kasumi-1TR2细胞逆转耐药作用机制的研究目的：探讨LBH589在体外对Kasumi-1TR2细胞逆转耐药作用的机制。方法：采用实时定量PCR法和Western-blot法检测不同浓度的LBH589作用于Kasumi-1TR2细胞,经不同作用时间后耐药相关基因DR4、BCL2、BCL2A1和IFNAR1 mRNA及蛋白表达的变化；采用实时定量PCR法和Western-blot法检测rsTRAIL、LBH589单独及联合作用于Kasumi-1TR2细胞后,DR4和BCL2 mRNA及蛋白表达的变化。结果：(1)实时定量PCR法检测LBH589单独及联合使用可以上调DR4 mRNA(P<0.05),下调BCL2 mRNA (P<0.05)。(2) Western-blott法检测LBH589单独及联合使用可以上调DR4总蛋白(P<0.05),下调BCL2总蛋白(P<0.05),且联合使用下调BCL2总蛋白的作用更显著(P<0.05)。结论：LBH589对Kasumi-1TR2细胞逆转耐药作用的机制与DR4上调及BCL2下调有关。