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流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),又称日本乙型脑炎,是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起的一种自然疫源性人畜共患传染病。该病为蚊虫传播的中枢神经系统性传染病,主要发生在亚洲南部及太平洋沿岸地区,可导致人类和马的脑炎症状及猪的繁殖障碍性疾病。到目前为止,除了接种疫苗及采取防蚊措施可用于预防感染外,对其尚且没有直接有效的治疗方法。随着全球气候的变暖,JE的流行有不断扩大的趋势,因此对于JE流行状况的监测显得尤为重要。NS1’蛋白是由JEV基因组在翻译过程的程序性移码而产生的,包括整个NS1蛋白和NS2A蛋白N端的9个氨基酸,其与病毒的毒力和神经嗜性有关。在病毒的复制过程中NS1’可以发挥NS1的功能,其能够与NS1蛋白及NS5蛋白发生互作,但是关于其与宿主蛋白之间的相互作用还未有报道。波形蛋白(Vimentin)作为细胞骨架蛋白Ⅲ型中间丝的一种,其已被证明在多种病毒的入胞及复制过程具有重要的作用。在DENV与CSFV感染的细胞中,Vimentin可以通过磷酸化作用而发生结构的重新排列,对于病毒的复制起到积极的作用。而在JEV感染的细胞中,目前只有关于Vimentin作为细胞受体介导JEV入胞的报道。本研究鉴定出一株JEV EDⅢ蛋白单抗(1B10)识别的抗原表位,并对其进行了保守性等分析。在此基础上,利用纯化的重组JEV EDⅢ蛋白和HRP标记的1B10单抗建立了检测JEV抗体的阻断ELISA,并初步应用于临床猪、牛和羊血清的JEV抗体检测,结果表明该阻断ELISA具有良好的应用前景。此外,本研究证实了 JEV NS1’蛋白与Vimentin在细胞内存在相互作用,同时还发现了 Vimentin在JEV感染的A549细胞内存在明显的结构重排现象。具体研究内容为以下3个部分:1.JEV EDⅢ蛋白单抗表位的鉴定为鉴定本实验室制备并保存的一株JEV EDⅢ蛋白单克隆抗体(1B10)识别的抗原表位。本研究首先由Western blot鉴定1B10单抗识别EDⅢ蛋白前段,然后根据该段氨基酸序列设计并合成了 6段抗原短肽JE1-JE6作为包被抗原,由ELISA结果可知1B10单抗识别JE6,最后根据该段序列构建表达载体pGEX-6P-1-JE61、JE62并成功表达目的蛋白,最终确定出1B10单抗识别的抗原表位为356SLNDMTPVGR365。经对比分析可知该表位处于EDⅢ蛋白的优势抗原区域内且在5种JEV基因型中均是高度保守的,为JE疫苗的研制及JEV诊断方法的建立奠定了基础。2.检测JEV抗体阻断ELISA的建立为建立可以用于多种动物JEV抗体检测的ELISA方法,本研究利用纯化的JEV EDⅢ蛋白作为包被抗原及HRP标记的JEV单抗(1B10)作为检测抗体建立了阻断ELISA。经反应条件的优化确定该阻断ELISA的最佳反应步骤,通过100份JEV抗体阴性猪血清的检测结果确定阻断率判定标准:PI≥34%时判定为阳性,PI≤25%时判定为阴性,25%
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