目的:　　 肺纤维化(PF)是最常见的肺间质疾病也是呼吸系统最严重疾病之一,因肺纤维化具有原因不明,致病机制不清,是多因素的结果,近年来信号传导通路在肺间质纤维化发生过程中的异常改变及其导致细胞生长失控的机制成为研究的热点。　　 近年来有研究发现,磷酸化蛋白激酶B(AKT/PKB)信号传导通路在肺纤维化中细胞增殖、分化、新陈代谢及凋亡过程中有着重要作用。在一些病理因素的刺激下,AKT蛋白转录增加或调节异常导致其过度表达或异常活化,通过作用于下游分子影响细胞周期进程,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进肺间质纤维化生物学行为。可被AKT/PKB通路直接或间接影响下游分子主要包括细胞增殖和蛋白合成相关因子和一些凋亡相关因子。核转录因子kB(NF-kB),作为信号传导通路的中枢,是AKT下游重要因子之一,通常与其抑制蛋白(inhibitorofKB,IKB)结合,以无活性形式存在于细胞质中。它的主要形式为p50和p65组成的二聚体,p50是DNA结合部位,p65参与基因转录起始调节。在一些病理因素的刺激下,NF-kB的异常活化可调节与细胞增殖和凋亡有关的基因转录,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。　　 AKT及其下游信号分子在肺纤维化中的表达及意义,目前国内外研究尚少。本实验采用免疫组化sP法检测磷酸化AKT(p-akt)、NF-kap65在小鼠肺纤维化中的表达情况,探讨磷酸化AKT、NF-kBp65在肺纤维化发生发展中的作用,为肺纤维化的发病机理及治疗提供新的理论依据及新的治疗靶点。　　 材料与方法:　　 一、实验材料　　 (一)实验对象　　 8周龄雌性C57BL/6小鼠(体重17～20克),无特殊病原体SPF级(北京维通利华实验动物技术公司),寄养于中国医科大学附属盛京医院动物中心。　　 (二)主要试剂　　 1、博莱霉素A2(BLM-A2)15毫克/支(日本化药株式会社,批号:H20040205)　　 2、小鼠抗兔NF-kBp65多克隆抗体,小鼠抗兔磷酸化AKTt(ser473),(ThermoTaKaRa南京凯基公司)　　 3、即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)　　 二、实验动物模型的建立、分组与标本处理　　 (一)实验动物模型建立、分组　　 将60只C57BL/6雌性小鼠随机分为实验组与对照组。所有实验小鼠均用lO%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,无菌手术暴露气管进行模型制作。实验组(BLM组):50只,第0天向每只小鼠气管内分别注射20ul含BLM·A2(5mg/kg)的无菌生理盐水。对照组:10只,第0天气管内注入生理盐水20ul。　　 (二)标本的采集与处理　　 在实验的第1、3、7、14、28天对实验组取材,每次随机选取10只。第7、14天对对照组取材,每次随机选取5只。以腹腔主动脉放血法处死实验小鼠,将左肺完整取出,放入4%多聚甲醛中固定3h,常规石蜡包埋,制成4um厚的组织切片,行苏木素.伊红染色及免疫组化　　 三、肺组织常规病理分析　　 (一)常规病理　　 肺组织经不同浓度酒精常规脱蜡至水,行HE染色。　　 (二)肺泡炎症及纤维化程度的组织病理学评分方法　　 依照Szapid法确定肺泡炎症及纤维化程度,两者均分4级,分别记为1、2、3、4分。　　 四、实验方法及检测指标　　 应用免疫组织化学技术(SP法)检测肺组织内NF-kBp65、p-akt的定位及表达。　　 五、统计学分析　　 应用SPSS17.0统计软件进行分析,所有数据均以均数士标准差表示,计量资料组间比较采用独立样本t检验,组内不同时间点比较采用单因素方差分析,单因素相关分析采用spearson相关分析法,P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果:　　 一、肺组织的病理变化　　 (一)大体观察　　 对照组各时间段双肺表面光滑有光泽质地软色粉红,实验组第7,14天双肺无光泽可见散在灶性出血点(尤以第7天最为明显),第28天可见双肺苍白、色灰暗无光泽,质地硬。　　 (二)肺组织病理HE染色显示　　 对照组未见明显的炎症细胞及大片实变改变。实验组第1天仅见少量炎性细胞,肺泡壁无明显变化,小鼠经气管注射BLM后第3天,可见肺泡壁略增宽,肺泡腔和肺间质内有炎性细胞渗出;第7天,肺组织内呈现典型肺泡炎改变,可见肺泡腔及肺质内大量的炎性细胞浸润以中性粒细胞淋巴细胞巨噬细胞为主,肺泡间隔增厚,第14、28天肺泡炎开始减轻,肺泡间隔明显增厚,大量肺泡萎陷,结构破坏,形成多发片状实变。　　 二、肺泡炎症病理学评分结果　　 肺泡炎症程度病理学评分　　 气管注射博莱霉素后各时间点,肺泡炎症评分与对照组比较(1.0±0.00)均有统计学意义(P＜0.01)。第7天肺泡炎病理评分最高,为3.4±0.50。　　 三、肺组织磷酸化AKT和NF-KBp65的免疫组化染色结果　　 (一)肺组织磷酸化AKT免疫组化染色结果　　 在实验组小鼠肺组织中,可见成纤维细胞、肺泡上皮细胞、支气管黏膜上皮细胞及血管内皮细胞磷酸化AKT免疫组化染色呈阳性,且可见多数胞浆呈阳性表达。各时间点与对照组比较,磷酸化AKT蛋白的表达均明显增强(P＜0.05),且随时间的移进一步增高,14和28天表达最强(P＜0.05)。正常对照组小鼠肺组织上述细胞仅部分胞浆呈弱阳性染色,　　 (二)NF-kBp65免疫组化染色结果　　 在BLM组各时间点处可见肺泡上皮细胞、肺泡间质细胞、支气管黏膜上皮细胞、血管内皮细胞及炎性细胞P65免疫组化染色呈阳性,且可见多数胞核呈阳性表达。正常对照组小鼠肺组织上述细胞仅部分胞浆呈弱阳性染色,未见细胞核着色,且第7天与第14天比较无差异(P＞0.05)。实验组各时间点的P65表达均较正常对照组明显升高(P＜0.05)。气管注射BLM后第l天,表达水平明显高于3天、7天、14天和28天(P＜0.05),第3天表达较第1天降低(P＜0.05),并呈逐渐下降趋势,但28天仍明显高于对照组(P＜0.05)。　　 四、磷酸化AKT及NF-kBp65表达相关性分析　　 气管注射BLM后(1-3天)NF-kBp65与p-akt呈正相关(r=0.359,P＜0.05)。　　 结论:　　 1、p-AKT、NF-kBp65蛋白在肺纤维化中的表达阳性率显著高于正常肺组织;　　 2、在肺纤维化早期,磷酸化AKT及NF-kBp65蛋白表达呈正相关,提示两者在肺纤维化发生发展过程中存在协同作用。