谷胱甘肽（GSH）是体内重要的抗氧化、抗炎物质，对保护组织器官免受氧化损伤具有重要作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成GSH的限速酶，其催化亚单位GCLC具有全酶的催化活性。对于该酶基因表达调节的了解能够有助于在分子水平阐明GSH变化的机制。我们前期的研究发现，GCLC基因上游调控序列存在一个转录抑制区域，其中两个E-box元件（-804～-799，-729～-724）在大鼠多种组织来源的细胞中起负性调控作用，并且具有组织特异性。文献报道和我们的实验结果均提示E-box元件具有双向调控的性质，这一特点与旁侧元件的组成以及结合的转录因子有关。为此分析了大鼠GCLC基因上游调控序列中与E-box元件相邻的元件，其中AHR/ARNT元件引起我们的关注。该基因上游存在两个核心序列同为CACGGG的AHR/ARNT元件，其中一个（-1090～-1085）位于E-box元件附近。其结合的转录因子芳香烃受体核转位蛋白（ARNT）是许多bHLH-PAS蛋白共同的专性二聚化配偶体，其中包括芳香烃受体（AHR）、低氧诱导因子（HIF）1α和2α、SIM蛋白等，参与机体内许多重要的生物学过程。由于有报道指出转录因子ARNT能够与E-box元件的结合蛋白USF1/2形成异源二聚体，使得E-box元件与ARNT之间相互作用的假设在理论上具有可信性，并且由于其结合的转录因子与低氧、毒物代谢等生命活动相关，故如果该关系存在，就可能解释众多关于细胞应激以及氧化-抗氧化平衡等问题。为此本研究首先对这两个AHR/ARNT元件在大鼠的GCLC基因转录中是否具有调控作用进行了系统分析。 目的:探讨位于转录起始位点上游-1090～-1085与-215～-210bp处的两个AHR/ARNT元件对RTE细胞内的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）催化亚单位（GCLC）是否具有转录抑制作用，从而了解γ-GCS基因转录调节特征。 方法: 1、报道载体以及真核表达载体的构建：（1）缺失AHR/ARNT元件报道载体：单缺失AHR/ARNT元件报道载体的构建是以GCLC-luc（-1758～+2）为模板，按照引物导入核心序列缺失的方法，通过两次PCR扩增出缺失-1090～-1085或-215～-210的AHR/ARNT元件的片段。两种PCR产物胶回收后连入pGEM-T easy载体，以SacⅠ/XhoⅠ双酶切插入pGL3-enhancer载体鉴定并测序。双元件缺失载体GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc的构建是以GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-Luc为模板进行两轮PCR扩增，其余步骤与上述相同。（2）AHR/ARNT元件核心与相邻序列报道载体：合成含有核心序列并包括相邻序列的AHR/ARNT（-1090）和AHR/ARNT（-215）正义和其反向互补链，预留SacⅠ/XhoⅠ酶切位点，采用逐渐退火的方法使两条单链互补配对，然后利用这两个位点按常规分子克隆技术将片段克隆入pGL3-promoter载体。（3）真核表达质粒：按Invitrogen公司的Trizol试剂提供的方法提取大鼠肝脏总RNA，使用逆转录试剂合成大鼠肝脏cDNA，PCR扩增出AHR、AHRR、ARNT2、ARNT片段。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收后连入pGEM-T easy载体，HindⅢ/NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序正确目的基因片段按照常规克隆技术连入pRc/CMV2载体并测序证实。 2、调控序列的细胞内促转录活性的测定：将GCLC-Luc、单缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc、双缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc、PGL3-Promoter以及含有AHR/ARNT元件核心与旁侧序列的报告基因载体转染大鼠RTE细胞，检测转染后细胞的萤光素酶活性值，来判断AHR/ARNT元件对GCLC基因转录活性的影响。 3、与AHR/ARNT元件可能结合的转录因子过量表达实验：将GCLC-Luc、缺失AHR/ARNT元件和双缺失AHR/ARNT元件的报告基因载体分别与四种真核表达质粒AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2-CMV2共转染大鼠RTE细胞，通过增强AHR/ARNT元件与可能和该元件结合的反式作用因子的作用，观察其对GCLC基因转录活性的影响。 4、电泳迁移率变动分析实验（EMSA）以及Supershift：观察在RTE细胞中AHR/ARNT元件是否有核蛋白特异性结合，并用Supershift检测其结合的转录因子是否是前期实验所推测的转录因子AHR以及ARNT。 结果: 1、成功构建含GCLC上游启动子序列分别单缺失AHR/ARNT元件（-1090～-1085以及-215～-210）的报告基因载体（GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-luc、GCLC-delAHR/ARNT（-215）-luc），双缺失AHR/ARNT元件的报告基因载体（GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc），含有AHR/ARNT元件核心与旁侧序列的报告基因载体（AHR/ARNT（-1090）-Promoter以及AHR/ARNT（-215）-Promoter）以及真核表达载体AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2-CMV2。 2、实验中将GCLC-Luc及其定点缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc以及PGL3-Promoter、AHR/ARNT（-1090）-Promoter和AHR/ARNT（-215）-Promoter转染大鼠支气管上皮细胞（RTE），结果表明缺失AHR/ARNT元件（-1090～-1085）的GCLC基因5’-上游序列的转录活性明显高于野生型基因5’-上游序列，GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-luc在细胞内萤光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.16倍；而缺失两个AHR/ARNT元件的效果与缺失上述元件相同，GCLC-DdelAHR/ARNT-luc萤光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.21倍，两者均差异显著；转染AHR/ARNT（-1090）-Promoter的萤光素酶值明显高于转染PGL3-Promoter的萤光素酶值，是PGL3-Promoter的2.61倍。实验结果说明AHR/ARNT元件（-1090～-1085）在RTE细胞中具有转录调节活性，而在GCLC基因的基础状态下的转录表达中起抑制作用。 3、将AHR-CMV2和GCLC-Luc以及单缺失或双缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共转染RTE细胞的萤光素酶值与CMV2空载体和GCLC-Luc以及单缺失或双缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共转染RTE细胞的萤光素酶值进行比较。结果提示GCLC-Iuc和CMV2空载体共转染的萤光素酶值是GCLC-luc和AHR-CMV2共转染的萤光素酶值的2.37倍。这说明转录因子AHR的过表达对GCLC基因具有负性调控作用，而其它转录因子AHRR、ARNT以及ARNT2的过表达对GCLC基因不具有明显调控作用。 4、电泳迁移率变动分析（EMSA）以及Supershift结果显示GCLC基因上游调控区域的两个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合，并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT。 结论:GCLC基因-1090～-1085区段功能元件AHR/ARNT在大鼠GCLC基因中属抑制元件，在GCLC基因基础状态表达中起负调控作用。