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研究背景:胃癌作为较常见的恶性肿瘤,早期一般无明显的临床症状,一经确诊,多数已属于II、III期,化疗在进展期胃癌的综合治疗中有着重要地位。虽然目前在化疗药物和化疗方案方面取得了极大地进步,但是多数患者预后不理想,主要是因为肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生,导致了很多胃癌患者的化疗失败。所以,探寻胃癌产生多药耐药的原因以及具体机制,以寻求高效、低毒的逆转剂,已经成为目前在胃癌研究领域的重中之重。此前,本实验室建立了S100A6低表达的7901稳定转染细胞,结果发现S100A6低表达可在一定程度上降低胃癌细胞的耐药性,而且S100A6表达下调的同时β-catenin也呈现一定程度的低表达,认为S100A6与β-catenin可能是正相关关系。在此基础上为了探寻β-catenin与胃癌MDR的关系,本研究拟构建β-catenin低表达的SGC7901/ADR细胞株,观察β-catenin下调是否能够在一定程度上逆转胃癌的多药耐药性,以探讨β-catenin与胃癌多药耐药的关系。目的:本实验通过RNA干扰转染技术下调SGC7901/ADR耐药细胞株β-catenin的表达,观察β-catenin下调后SGC7901/ADR多药耐药性变化,以探讨β-catenin与胃癌多药耐药的关系。方法:培养阿霉素耐药细胞株SGC7901/ADR,应用脂质体转染法将sh RNA质粒转染到SGC7901/ADR细胞中。将SGC7901细胞、SGC7901/ADR细胞、sh RNA-CTNNB1质粒转染细胞和sh RNA-NC质粒转染细胞进行培养,每种细胞提取其总蛋白和总RNA,进行Western blotting实验以及RT-PCR实验,在蛋白水平和RNA水平分别来分析β-catenin在这四种细胞中的差异表达。将这四种细胞分别接种在96孔板上进行CCK8实验,在450nm处依次测定每一孔细胞的OD值,根据OD值,运用寇氏改良法公式可以计算出这四种细胞的IC50(药物半抑制浓度)和RI(耐药指数)。结果:1.成功转染耐阿霉素细胞株SGC7901/ADR,得到了β-catenin表达下调的sh RNA-CTNNB1转染细胞株和阴性对照sh RNA-NC转染细胞株。2.Western blotting结果:β-catenin蛋白在7901细胞、耐阿霉素的SGC7901/ADR细胞、β-catenin表达下调的sh RNA-CTNNB1转染细胞、阴性对照的sh RNA-NC转染细胞平均表达量为0.434±0.244、1.372±0.264、0.661±0.083、1.436±0.178。两个独立样本的t检验做四种细胞的两两比较,SGC7901/ADR细胞与SGC7901细胞、sh RNA-CTNNB1转染细胞比较,P<0.05,差异性显著;SGC7901/ADR细胞与sh RNA-NC转染细胞比较,P>0.05,差异性不显著;SGC7901细胞与sh RNA-CTNNB1转染细胞比较,P>0.05,差异性不显著。3.RT-PCR结果:β-catenin基因m RNA在7901细胞、耐阿霉素的SGC7901/ADR细胞、β-catenin表达下调的sh RNA-CTNNB1转染细胞、阴性对照的sh RNA-NC转染细胞中的平均表达量为0.659±0.05、1.106±0.043、0.747±0.027、1.111±0.043。两个独立样本的t检验做四种细胞的两两比较,SGC7901/ADR细胞与SGC7901细胞、sh RNA-CTNNB1转染细胞比较,P<0.05,差异性显著;SGC7901/ADR细胞与sh RNA-NC转染细胞比较,P>0.05,差异性不显著;SGC7901细胞与sh RNA-CTNNB1转染细胞比较,P>0.05,差异性不显著。4.CCK8实验结果:阿霉素作用下7901细胞、耐阿霉素的SGC7901/ADR细胞、β-catenin表达下调的sh RNA-CTNNB1转染细胞、阴性对照的sh RNA-NC转染细胞的IC50分别为0.378±0.026ug/ml、1.371±0.044ug/ml、0.497±0.017ug/ml、1.414±0.079ug/ml。两个独立样本的t检验做四种细胞的两两比较,SGC7901/ADR细胞与SGC7901细胞、sh RNA-CTNNB1转染细胞比较,P<0.05,差异性显著;SGC7901/ADR细胞与sh RNA-NC转染细胞比较,P>0.05,差异性不显著;SGC7901细胞与sh RNA-CTNNB1转染细胞比较,P<0.05,差异性显著。结论:1.重组质粒表达载体p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-CTNNB1可以有效的干扰SGC7901/ADR细胞中β-catenin的表达,并特异性抑制SGC7901/ADR细胞中β-catenin的m RNA和蛋白质的表达。2.β-catenin的表达与阿霉素耐药胃癌细胞株SGC7901/ADR的多药耐药呈正相关,β-catenin蛋白可能参与了胃癌MDR的产生。