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类固醇激素作为促生长剂，在畜牧业中常常被用来促进体重增加、提高瘦肉生成率、促进动物同期发情和提高饲料转化率等以提高经济利益。动物源食品中残留类固醇激素会导致代谢紊乱、生长发育缺陷和潜在的致癌致畸等健康危害。因为食品动物本身可分泌天然类固醇激素，当滥用的合成类固醇激素与天然类固醇激素一致时，而采用传统检测技术（GC/MS和LC-MS/MS）评价分析其生理学浓度难以判断其是否违禁使用。气相色谱/燃烧炉/同位素比值质谱法（GC/C/IRMS）是目前鉴别类固醇激素来源的有效方法。国内外尚未有对动物源食品中残留激素进行溯源的研究，因此，急需建立类固醇激素鉴别技术，为我国的动物源食品安全监控提供技术保障。本文建立了动物源性食品中睾酮（T）、表睾酮（EpiT）、雄酮（A）、本胆烷醇酮（E）、脱氢表雄酮（DHEA）、孕酮（P）、孕二醇（PD）、孕三醇（PT）、雌酮（E1）、-雌二醇（-E）、β-雌二醇（β-E）、雌三醇（E3）、氢化可的松（H）和丙酸睾酮（TP）等14种类固醇激素的定量检测方法，以及动物源食品中T、EpiT、A、E、DHEA、P、PD、PT、E1、-E、β-E和E3等12种类固醇激素来源的GC/C/IRMS鉴别技术。定量检测技术是鉴别技术的基础和前提，采用定量检测技术不能检出或检出量很低的实际样品中残留的目标分析物，则不必要进行GC/C/IRMS鉴别试验。建立了检测动物源食品中14种类固醇激素残留的HPLC-MS/MS定量检测技术。流动相选择乙腈（B）和水（A）。雄性激素、糖皮质激素和孕激素的分离由Agilent Poroshell120EC-C18（150×2.1mm，2.7μm）色谱柱实现。梯度洗脱程序为：0.0min（35%B）12.0min（70%B）21.0min（100%B）21.1min（35%B）26.0min（35%B）；流速为200μL/min；雌性激素由YMC Hydrosphere C18（100×2.0mm，3μm）色谱柱实现分离。梯度洗脱程序为：0.0min（35%B）12.0min（70%B）13.0min（70%B）13.1min（35%B）18.0min（35%B）；流速为250μL/min。检测灵敏度高（LODs=0.004-1.60μg/kg）。建立了同时提取动物源食品中14种残留类固醇激素的样品前处理方法。所建方法均适用于动物肌肉组织（生肉）、牛奶和鸡蛋等动物源食品的前处理。均质样品酶水解乙腈提取ZnCl2脱脂C18-Si-NH2-SPE柱净化HPLC-MS/MS检测。激素提取率高（回收率：77.7-119.0%），净化效果高，基质效应干扰小（牛肉ME=-1.1%~-22.4%）。建立了黄油样品中残留类固醇激素的凝胶渗透色谱（GPC）净化方法。流动相为乙酸乙酯/环己烷（1/1，v/v）；流速为4.7mL/min。色谱柱预洗时间、前运行时间、主收集时间、尾洗时间分别为0.17min、10.7min、33.3min和4min。样品处理：黄油样品环己烷/乙酸乙酯溶解振荡提取离心上清液GPC浓缩净化收集浓缩液吹干、定容HPLC-MS/MS检测。所建方法操作过程简单，去除油脂效果好，提取效率高（回收率：64.1-110.0%）。建立了类固醇激素的Pre-HPLC浓缩、纯化技术。色谱柱选择反相C18色谱柱；流动相为乙腈（B）和水（A）；梯度洗脱程序为：0.0min（40%B）20.0min（80%B）25.0min（100%B）30.0min（100%B）；流速为15mL/min；柱温为室温；检测波长采用同时多元紫外波长（192nm、200nm和242nm）分析。类固醇激素分离度良好，满足GC/C/IRMS对目标分析物高纯度的要求。建立了类固醇激素GC/MS定性定量方法。采用不分流模式进样；前进样口和辅助通道温度：280℃；离子源温度：230℃；MS四级杆温度：150℃；色谱柱流量：1mL/min，恒流模式；色谱柱升温程序：初始温度为80℃，保持1min，以15℃/min速度升至250℃，保持2min，以2℃/min速度升至272℃，保持5min。类固激素分离度良好，目标分析物色谱峰无交叉干扰，满足了GC/C/IRMS测定的特异性和准确性要求。建立了溯源动物源食品中残留类固醇激素的GC/C/IRMS方法。GC色谱柱和升温程序与GC/MS的一致；进样口温度：250℃；FID检测器温度：200℃；燃烧炉和燃烧界面温度分别为850℃和350℃。目标分析物分离度良好，色谱峰无交叉干扰，测定的类固醇激素的13C值准确性和特异性好。动物源食品中外源性类固醇激素13C值范围在-28‰至-38‰之间；内源性类固醇激素的13C值范围为>-27‰。如黄油样品中内源性孕酮13C值范围在-26.77±0.26‰和-23.72±0.28‰之间，而加标样品中外源性孕酮13C值为-30.57±0.12‰，单因素方差分析（ANOVA，P值=0.003<0.05）显示内源性孕酮和外源性孕酮13C值之间存在显著差异性；猪卵巢中内源性孕酮13C值范围在-22.32±0.13‰和-20.44±0.16‰之间，而加标样品中外源性孕酮13C值为-30.66±0.15‰，内、外源性13C值的ANOVA分析P值=0.001也显示差异性显著；鸡卵样品中13C值范围在-17.09±0.45‰和-25.84±0.38‰之间，而纯外源性孕酮13C值为-30.72±0.03‰，ANOVA分析也显示差异性显著。所有类固醇激素GC/C/IRMS方法的灵敏度为10-100ng；批内精密度为0.09-0.15‰，批间精密度为0.11‰；溶于甲醇的类固醇激素标准溶液13C值1年内稳定性好（SD<0.5‰），而溶于环己烷的GC/C/IRMS类固醇激素工作液室温或4℃放置三天，13C值稳定性差，配制后应立即分析；研究发现Pre-HPLC馏分接收过程是同位素分馏现象发生和影响测定准确性的关键步骤。因此，GC/C/IRMS是鉴别动物源食品中残留类固醇激素的有力工具。