徽派白酒(文王贡)窖泥原核微生物群落结构分析及初步工艺调控研究

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徽派浓香型白酒采用传统固态发酵工艺,其中窖泥微生物随着发酵的进行迁移到糟醅中,参与有机酸等风味化合物的形成,对于徽派浓香型白酒的风味起着重要作用。高品质的白酒通常与高质量的窖泥相关,而影响窖泥质量的因素主要是窖龄和发酵结束后的养护。本文以文王浓香型白酒3年和30年窖龄窖泥为研究对象,对池底不同维度(水平、垂直)的窖泥进行了较为系统的分析。采用高通量测序解析窖泥微生物的差异与演替规律,研究不同维度窖泥与其理化性质的相关性,并采用共培养的方式对主要影响因子验证,丰富了新老窖泥的养护理论。采用传统分离的方式对窖泥中高产己酸的微生物进行了分离,为新老窖泥的养护工艺提供了微生物材料。主要研究结果如下:(1)新窖泥多维原核群落差异演替与理化关联分析。采用高通量测序技术对新窖泥的微生物检测发现,厚壁菌门(Firmicutes)是新窖泥中主要门水平微生物,新窖泥中主要的微生物属是乳酸杆菌属(Lactobacillus),芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)。水平维度三个区位((拐角(Cor)、中间(Mid)和中心(Cen))中,新窖泥的Cor区位窖泥微生物的丰度和多样性更高,Cor区位的微生物质量更好。产己酸菌属(Caproiciproducens)和氢孢菌属(Hydrogenispora)在三个区位存在显著差异(P<0.05)。新窖泥中Cor区位相比于Mid区位和Cen区位窖泥的p H较高、腐殖质含量较高,总酸含量较低,有机酸中己酸含量较高,乳酸含量较低,Cor区位的理化质量更好。对垂直维度的新窖泥样品进行分组发现,新窖泥在垂直维度以4 cm为界线分为浅层与深层两组,窖泥垂直维度的微生物差异明显高于水平维度。在新窖泥中,乳酸杆菌属(Lactobacillus)在浅层和深层窖泥中丰度均最高,芽孢杆菌属(Bacillus),梭菌属(Clostridium)和克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)的丰度随着窖泥深度的增加而增加,取代乳酸杆菌属(Lactobacillus)成为深层窖泥的优势微生物。浅层窖泥中的含水量、酸度、腐殖质和乙醇的含量高,深层窖泥中p H、有效磷含量高,从微生物和理化角度分析,新窖泥中深层窖泥质量更好。对垂直维度的新窖泥与理化因子的相关性分析表明:浅层窖泥与水分、己酸、丁酸、乳酸、乙酸和腐殖质的含量呈正相关,深层窖泥与氨态氮、有效磷的含量和p H呈正相关。新窖泥中梭菌属(Clostridium)和芽孢杆菌属(Bacillus)与窖泥深度呈显著正相关,这两类微生物可能对于新窖泥的成熟具有重要作用。运用PICRUSt2工具预测不同深度新窖泥中四种典型有机酸(己酸、丁酸、乙酸、乳酸)的代谢途径中关键酶的相对丰度发现,随窖泥深度的增加,与己酸和丁酸代谢相关的酶丰度升高,与乳酸代谢相关酶的丰度降低。(2)老窖泥多维原核群落差异演替与理化关联分析。采用高通量测序技术对老窖泥的微生物检测发现,厚壁菌门(Firmicutes)也是老窖泥中主要门水平微生物。新老窖泥微生物在属水平存在显著不同。老窖泥中主要的微生物属是产己酸菌属(Caproiciproducens),Fastidiosipila和氢孢菌属(Hydrogenispora)。水平维度三个区位中,Mid区位窖泥微生物的丰度和多样性最高,氨基酸属(Aminobacterium)和Haloplasma属在三个区位存在显著性差异,Mid区位老窖泥腐殖质、己酸、丁酸的含量最高,表明水平位置老窖泥Mid区位窖泥的质量更好。对垂直维度的老窖泥样品进行分组发现,窖泥同样在垂直维度以4 cm为界线分为浅层与深层两组,垂直维度的微生物差异明显高于水平维度。在老窖泥中,浅层窖泥中产己酸菌属(Caproiciproducens)占据优势,随窖泥深度增加,Fastidiosipila和氢孢菌属(Hydrogenispora)取代产己酸菌属(Caproiciproducens)成为优势微生物。含水量、腐殖质、有机酸、氨基酸随深度增加而降低,p H随窖泥深度增加而增加,微生物多样性和丰度度随窖泥深度的增加而增加,表明老窖泥中深层窖泥质量更高。对垂直维度的老窖泥与理化因子的相关性分析表明:浅层窖泥与水分、己酸、丁酸、乳酸、乙酸和腐殖质的含量呈正相关,深层窖泥与氨态氮、有效磷的含量和p H呈正相关。对老窖泥中微生物与有机酸相关性分析表明,产己酸菌属(Caproiciproducens)、Caloramatoraceae与老窖泥中有机酸呈正相关。(3)从窖泥中分离得到11株产己酸与丁酸的细菌,其中一株细菌产酸量最高,己酸产量为1.90 g/L,丁酸产量为8.54 g/L,结合理化特征及分子生物学鉴定,该细菌与产己酸菌属(Caproiciproducens)具有97%的相似性。通过共培养窖泥中的功能微生物克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和新窖泥中的优势微生物植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),发现克氏梭菌(Clostridium kluyveri)能够抑制植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的生长。调整共培养体系中的理化条件,验证相关性分析得到对窖泥显著影响的p H、氨态氮、有效磷和合成己酸的底物乙酸,结果表明在偏中性p H条件下(p H7-8),共培养体系中克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的产酸性能最强,0.13%含量的氨态氮对于共培养体系中克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的产酸性能有促进作用,而有效磷和乙酸对于共培养体系是显著的抑制作用。综上,本论文对比分析新老窖泥不同区位、深度窖泥原核微生物群落,并结合理化因子有机酸进行了较为系统的分析,同时采用分离和共培养的方式对相关性分析进行了验证,该研究进一步丰富了对徽派浓香型白酒的窖泥的理论研究,指导新老窖泥的养护。
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