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以转TrxS基因啤酒大麦晋引六号(JY6)纯合株系籽粒和未转基因对照为材料,研究了TrxS基因的表达及其对啤酒大麦发芽种子水解酶和贮藏物质降解的影响。主要结论如下:
1、TrxS基因在啤酒大麦中的表达
用Trizol提取发芽3天的转基因和对照籽粒中的总RNA,采用RT-PCR技术证明了TrxS基因在转录水平上得到表达。测定了转基因大麦和对照发芽籽粒中硫氧还蛋白h(Trxh)活性,结果表明,转基因籽粒和对照Trxh活性变化趋势相同,但转基因籽粒Trxh活性始终高于对照,在第2~4天分别比对照的最大值高17.61%、16.21%和6.35%。而且转基因籽粒中Trxh活性高峰值还比对照提前,证明了TrxS基因的表达对Trxh催化活性的增强作用。
2、TrxS基因对发芽种子淀粉水解酶和淀粉降解的影响
研究了TrxS基因对发芽籽粒中α-淀粉酶活性、α-淀粉酶抑制蛋白含量、游离态β-淀粉酶活性、束缚态β-淀粉酶活性、极限糊精酶活性和淀粉含量的影响。结果表明:转基因大麦籽粒中α-淀粉酶活性高于对照,α-淀粉酶同工酶带比对照提前一天出现;α-淀粉酶抑制蛋白的降解速度快于对照,比对照早1天消失。说明TrxS基因的表达,通过还原α-淀粉酶抑制蛋白中的二硫键使其失活和促进发芽籽粒中α-淀粉酶抑制蛋白的降解,也相应提高了籽粒中α-淀粉酶活性。
转基因籽粒在发芽时游离态β-淀粉酶活性高于对照,同工酶带也比对照增强;同时,束缚态β-淀粉酶转化为游离态β-淀粉酶加快,比对照提早1天充分释放,表明TrxS基因的表达,一方面有利于维持巯基蛋白酶中的巯基(-SH)的存在,使巯基蛋白酶保持酶活性和发挥作用,促进束缚态β-淀粉酶向游离态β-淀粉酶的转变;另一方面,Trxh的活性的提高,也有利于维持游离态β-淀粉酶中的巯基(-SH)的存在,使其保持酶活性和发挥作用,因而提高了游离态β-淀粉酶的活性。转基因籽粒在发芽时极限糊精酶活性也得到提高。
转基因籽粒在发芽时淀粉含量下降加快,也说明TrxS基因的表达通过淀粉酶活性的提高,促进了籽粒中淀粉的降解。
3、TrxS基因对发芽种子蛋白酶和蛋白质降解的影响
研究了TrxS基因对发芽籽粒中蛋白酶活性,不同蛋白组分即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中巯基含量以及四种蛋白质含量、主要贮藏蛋白醇溶蛋白和谷蛋白SDS-PAGE图谱的影响。结果表明:转基因籽粒在发芽时蛋白酶活性明显提高,这可能是TrxS基因的表达通过还原种子中蛋白酶抑制剂分子内的二硫键(S-S)使其加速失活,同时有利于巯基蛋白酶中还原性巯基的存在,也进一步促进了巯基蛋白酶对蛋白酶抑制剂的降解作用。
转基因籽粒在发芽时清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等四种蛋白组分中巯基含量显著高于对照,说明TrxS基因导入大麦后,促进了胚乳蛋白中二硫键(S-S)向巯基(-SH)的转化,提高了籽粒中胚乳蛋白的还原状态和可溶性。同时蛋白酶活性的提高,加速了蛋白的降解。因此,转基因籽粒中醇溶蛋白和谷蛋白含量比对照显著降低,降解速率也快于对照,尤其是分子量介于31.0kDa~66.2kDa之间的蛋白组分(主要是B组和C组蛋白组分),由于醇溶蛋白和谷蛋白B组和C组占总量的85%以上,B组醇溶蛋白富含半胱氨酸,可通过形成分子间或分子内二硫键(S-S)而成聚合体,谷蛋白也是通过二硫键(S-S)连接的多肽单体组成。因此,转基因籽粒醇溶蛋白和谷蛋白降解加速与TrxS基因的表达和Trxh活性提高有直接关系。