论文部分内容阅读
纤维素酶在植物细胞壁多糖的生物降解中具有重要作用。这些植物细胞壁多糖由纤维素(35-50%)、半纤维素(20-35%)和木质素(5-30%)组成。纤维素是植物合成的主要碳水化合物,因此,其生物降解是生物圈内碳循环的重要组成部分。而在此过程中,纤维素酶起着非常重要作用。利用纤维素分解酶在工业生产中降解纤维素以获取所需的糖类物质,是生物技术学家的研究兴趣之一。但是目前工业纤维素酶普遍存在酶活低、成本高等问题,因此,利用和挖掘高效降解纤维素的微生物成为新的酶资源获取途径,这一举措具有重要的现实意义。红树林由于其特殊的地理位置,有规律地受到海水浸泡和露空,随着大量的植物残体和落叶的堆积,为微生物不断提供纤维素等营养物质,因此,从红树林生境获得产纤维素酶微生物具有广阔的研究前景。本论文通过筛选纤维素降解菌,获得两株芽孢杆菌,并对其进行内切葡聚糖酶重组表达及酶学特性研究,借助全基因组测序手段对两株纤维素降解芽孢杆菌的重要功能蛋白和基因资源进行挖掘,结果如下:].产酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学特性研究本研究成功从漳州紫泥红树林生态保护区土壤样品中筛选获得2株纤维素降解芽孢杆菌,分别为ms-2和ms-22,通过菌落形态、革兰氏染色、生理生化试验,结合16S rDNA基因片段比对鉴定菌株分别为 Bacillus subtilis ms-2 和 Bacillus xziamenensis ms-22。Bacillus subtilis ms-2于LB培养基培养24 h酶活性最高达到0.6557 U/mL,ms-2产的纤维素酶最适反应温度和pH分别为65 ℃和6.0,该酶具有较广范围的pH耐受性,适宜在中性偏酸性的条件下进行反应。Bacillusxiamenensisms-22在以CMC-Na为唯一碳源产纤维素酶初筛培养皿上可见水解圈,但其含有其它碳源或CMC-Na为唯一碳源液体培养基培养时,常出现菌体不生长或发生较早自溶,具体的作用机制还有待进一步分析研究。2.内切葡聚糖酶基因的表达、重组酶的纯化及酶学特性研究本实验根据GenBank中芽孢杆菌属已发表的纤维素酶基因序列设计引物,成功地分别从Bacillus subtilis ms-2和Bacillus xiamenensis ms-22 的基因组 DNA 中扩增得到内切葡聚糖酶基因。经分析,ms-2基因片段序列长为1542 bp,编码508个氨基酸,N端有信号肽,表达产物Celms2具有GH5/CBM3结构、大小约为56.5 KDa;酶学特性研究表明,Celms2最适反应温度和pH分别为60℃和5.0,在此条件下所产纤维素酶比酶活为20184.66 U/g,该酶具有良好的耐热特性,强酸耐受力差,适宜在中性偏酸性的条件下进行反应。ms-22序列长为2398 bp,编码616个氨基酸,经分析无信号肽,表达产物Celms22酶具有GH9/CBM3结构、大小约为69.6 KDa;酶学特性研究显示,Celms22最适反应温度和pH分别为70℃和6.0,在此条件下所产纤维素酶比酶活为7892.38 U/g,该酶具有良好的嗜热活性兼有较广的温度耐受范围,不耐强酸,最佳反应条件为中性偏酸性环境。3.目标菌株全基因组测序分别以Bacillus subtilis ms-2和Bacillus xiamenensis ms-22为出发菌株进行全基因组测序,结果显示ms-2的染色体为环状,大小为4 126 713 bp,G+C含量为43.79%,有4103个预测的基因,共含有458碳水化合物活性酶。经初步分析,ms-22的染色体为环状,大小为3 662 658 bp,G+C含量为41.51%,有3490个预测的基因,共含有428碳水化合物活性酶。经分析发现两株菌均具有一套非常高效的碳水化合物代谢途径,且注释结果显示含有大量的糖苷水解酶基因,结合KEGG注释结果,绘制了相关的代谢途径图谱,很多与碳水化合物代谢相关的酶被展示出来。4.比较基因组学分析经6株芽孢杆菌比较基因组学分析,明确了 ms-2、ms-22的进化关系,表明ms-2属于Bacillus subtilis、ms-22为Bacillusxiamenensis。研究表明芽孢杆菌属内同一物种菌株之间具有一定的同源性,除此之外,菌株也有其自身特异性,该属菌株在不同程度上均存在一定的与木质纤维素降解相关的酶基因,主要包括参与纤维素及半纤维素的分解相关基因,对于木质素降解相关基因相对匮乏。本论文在分离鉴定漳州紫泥红树林生态保护区土壤样品芽孢杆菌Bacillus subtilis ms-2和Bacillus xiamenensis ms-22的基础上,分别对其野生型菌株所产的纤维素酶和工程菌表达产物内切葡聚糖酶酶学特性进行了初步分析,并对菌株ms-2和ms-22全基因组进行了测序和分析,深层次挖掘碳水化合物活性酶相关基因,进一步了解芽孢杆菌属内菌株的生物学机制,促进芽孢杆菌属的高效利用和防控。