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大豆(Glycine max)是重要的经济作物,具有丰富的营养价值。大豆对盐害敏感,高盐胁迫下大豆的生长受阻、品质降低且产量下降。蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter,SUT)负责糖类物质在植物体内的跨膜运输,在植物响应逆境过程中发挥重要作用。目前已有多个大豆SUT基因被克隆鉴定,但主要集中在对基因生物学信息分析上,其在响应逆境中的作用却鲜有报道。因此,深入研究大豆SUT基因的功能,对理解该基因在大豆生长发育、响应逆境方面的作用具有重要意义。本研究克隆鉴定了大豆GmSUT4基因,对该基因的生物信息学、组织表达、亚细胞定位和盐胁迫下生理指标的变化等进行分析,利用VIGS技术初步对基因功能进行了验证,构建用于遗传转化的pBI121过表达载体和CRISPR/Cas9敲除载体,为今后全面研究该基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:
1、根据NCBI数据库中SUT4序列信息同源克隆获得GmSUT4基因。GmSUT4基因CDS序列全长1623bp,编码537个氨基酸,分子质量为57869.35Da,理论等电点9.43,含有GPH与MFS功能结构域,属于疏水性蛋白。GmSUT4与其他大豆SUT基因相似性较低,属于SUT4亚族,和莲藕、花生的SUT4蛋白亲缘最近。qRT-PCR结果显示,GmSUT4在根、茎和叶中均有表达,其中在根中的表达最高,茎中的表达最少。烟草瞬时表达结果显示GmSUT4定位在细胞质膜。
2、对NaCl处理后的大豆幼苗生理生化指标和GmSUT4基因的表达水平进行分析。大豆的株高、茎粗和鲜重均随着盐浓度升高而显著下降;根和叶中的SOD、POD活性和MDA的含量显著增加,而CAT活性随着盐浓度的升高先下降后上升,在150mM NaCl胁迫下活性最大;GmSUT4基因在根和叶中的表达均随着盐浓度增加而上升。相关性分析表明GmSUT4基因的表达量和生理生化指标存在关联,推测GmSUT4基因可能参与大豆对盐胁迫的响应。
3、构建了GmSUT4基因的VIGS载体,利用注射法注射大豆的真叶,qRT-PCR结果显示沉默植株中GmSUT4的表达水平显著降低,说明大豆中GmSUT4已被抑制。
4、150mM NaCl处理3天后,GmSUT4沉默植株叶片较对照植株明显枯萎,其中CAT、SOD、GR活性和脯氨酸含量显著下调,MDA含量上调,POD活性变化不显著;蔗糖、果糖和淀粉的含量分别降低了16.52%、9.75%和36.81%。
5、GmSUT4沉默导致糖合成相关基因GmSPS和GmCInv1的表达明显下调,GmSPP2下调不明显。说明GmSUT4可能参与调控糖合成相关基因的表达进而响应大豆的盐胁迫。
6、构建了pBI121-GmSUT4过表达载体和Cas9-GmSUT4载体,并已成功转化到农杆菌中,为以后进行遗传转化,全面研究该基因功能奠定基础。
1、根据NCBI数据库中SUT4序列信息同源克隆获得GmSUT4基因。GmSUT4基因CDS序列全长1623bp,编码537个氨基酸,分子质量为57869.35Da,理论等电点9.43,含有GPH与MFS功能结构域,属于疏水性蛋白。GmSUT4与其他大豆SUT基因相似性较低,属于SUT4亚族,和莲藕、花生的SUT4蛋白亲缘最近。qRT-PCR结果显示,GmSUT4在根、茎和叶中均有表达,其中在根中的表达最高,茎中的表达最少。烟草瞬时表达结果显示GmSUT4定位在细胞质膜。
2、对NaCl处理后的大豆幼苗生理生化指标和GmSUT4基因的表达水平进行分析。大豆的株高、茎粗和鲜重均随着盐浓度升高而显著下降;根和叶中的SOD、POD活性和MDA的含量显著增加,而CAT活性随着盐浓度的升高先下降后上升,在150mM NaCl胁迫下活性最大;GmSUT4基因在根和叶中的表达均随着盐浓度增加而上升。相关性分析表明GmSUT4基因的表达量和生理生化指标存在关联,推测GmSUT4基因可能参与大豆对盐胁迫的响应。
3、构建了GmSUT4基因的VIGS载体,利用注射法注射大豆的真叶,qRT-PCR结果显示沉默植株中GmSUT4的表达水平显著降低,说明大豆中GmSUT4已被抑制。
4、150mM NaCl处理3天后,GmSUT4沉默植株叶片较对照植株明显枯萎,其中CAT、SOD、GR活性和脯氨酸含量显著下调,MDA含量上调,POD活性变化不显著;蔗糖、果糖和淀粉的含量分别降低了16.52%、9.75%和36.81%。
5、GmSUT4沉默导致糖合成相关基因GmSPS和GmCInv1的表达明显下调,GmSPP2下调不明显。说明GmSUT4可能参与调控糖合成相关基因的表达进而响应大豆的盐胁迫。
6、构建了pBI121-GmSUT4过表达载体和Cas9-GmSUT4载体,并已成功转化到农杆菌中,为以后进行遗传转化,全面研究该基因功能奠定基础。