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前列腺癌是欧美国家最常见的男性恶性肿瘤之一,占男性癌症死因的第二位。我国前列腺癌发病率虽远低于西方国家,但近来随着人口老龄化及生活条件的改善,发病率呈显著增长趋势。骨骼是最常见的前列腺癌转移的靶器官,超过80%的前列腺癌患者会发生以成骨性表现为主的骨转移。骨转移确切的发生机制尚未完全清楚。骨髓问充质干细胞(MSCs)具有分化为多种中胚层来源的间质细胞(成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞)的能力,并且对肿瘤侵袭、生长有重要影响。因此,研究人MSCs(hBMSCs)与前列腺癌细胞相互作用对于阐明前列腺癌骨转移的发生机制以及创新前列腺癌的治疗方法具有重要意义。首先,本实验采用密度梯度离心与贴壁培养相结合方法分离hBMSCs。分离3天后换液去除未贴壁细胞,第4天可见分裂中的成纤维样贴壁细胞,第6d可见多个细胞克隆形成,第10d可见细胞呈均一的成纤维样细胞形态,呈多向螺旋生长,80%克隆汇合形成单细胞层。流式细胞术检测细胞表面抗原表达:CD29为99.64%,CD14为1.01%,CD45为0.89%,CD44为99.91%,CD90为95.04%,CD34为0.32%,CD166为82.55%,CD105为98.89%,HLA-DR为1.27%,HLA-ABC为98.69%。成骨诱导分化第14d碱性磷酸酶(ALP)染色显示细胞内大量紫红色颗粒形成,第21d Von Kossa染色显示钙盐沉积。脂肪诱导分化第8d,油红O染色显示细胞内大量脂肪滴形成。根据目前MSCs鉴定标准,本实验分离、培养hBMSCs获得成功。依据如下:1、从人骨髓分离、培养单个核细胞呈贴壁生长,呈成纤维细胞样外观;2、CD29、CD44、CD90、CD166、CD105和HLA-ABC表达阳性,CD14、CD45、CD34和HLA-DR表达阴性;3、可以被定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。其次,本实验探讨了hBMSCs对前列腺癌PC-3细胞迁移、侵袭作用的影响及机制。1、采用Boyden Chamber法检测PC-3细胞迁移、侵袭能力。检测迁移能力时,将PC-3细胞接种在上室,下室根据培养液不同分两组。Ⅰ组:PC-3培养基;Ⅱ组:含50%hBMSCs条件培养液的PC-3培养基。24h后棉签擦去上室膜上细胞,HE染色,镜下200倍视野记数细胞。检测侵袭能力时在上室聚碳酸酯膜上铺一层Matrigel胶,其余同迁移检测。2、应用real-time RT-PCR和western blot法检测基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的表达。根据培养液不同分两组。A组:PC-3培养基;B组:含50%hBMSCs条件培养液的PC-3培养基。24h后收集细胞检测。结果显示:1、A、B两组细胞迁移数分别为225.33±21.60和325.1±21,比较有统计学差异(t=-5.73,P=0.0046＜0.01);A、B两组细胞侵袭数分别为110.67±11.68和245.33±11.50,比较有统计学差异(t=-14.23,P=0.0001＜0.01)。2、MMP-2 mRNA表达量(RQ值):两组分别为0.96±0.04和1.19±0.05,比较有统计学差异(t=-5.98,P=0.0039＜0.01);MMP-2蛋白表达量(RGS):两组分别为0.50±0.12和1.04±0.18,比较有统计学差异(t=4.19,P=0.0138＜0.05)。3、MMP-9 mRNA表达量(RQ值):两组分别为10.67±0.984和25.40±1.32,比较有统计学差异(t=-15.49,P=0.0001＜0.01);MMP-9蛋白表达量(RGS)两组分别为0.17±0.01和0.46±0.07,比较有统计学差异(t=7.49,P=0.0017＜0.01)。结果显示hBMSCs增强前列腺癌PC-3细胞迁移、侵袭能力,该作用可能与PC-3细胞MMP-2,9表达增加有关。第三,本实验研究了前列腺癌PC-3细胞与hBMSCs相互之间对生长的影响。将hBMSCs细胞分为两组。Ⅰ组:对照组(hBMSCs培养基);Ⅱ组:PC-3条件培养液组(含50%PC-3条件培养液的hBMSCs培养基)。将PC-3细胞分为两组。A组:对照组(PC-3培养基);B组:hBMSCs条件培养液组(含50%hBMSCs条件培养液的PC-3培养基)。用CCK-8法检测细胞第1-7d活性。第4d流式细胞仪检测细胞周期变化和透射电镜观察细胞超微结构。结果:1、PC-3对hBMSCs生长的影响。Ⅰ组细胞第1-7d的光密度值(OD)分别为0.41±0.02、0.53±0.04、0.66±0.01、0.96±0.02、1.37±0.02、1.72±0.03和1.79±0.01;Ⅱ组细胞第1-7d的OD值分别为0.44±0.03、0.64±0.01、0.80±0.02、1.26±0.01、1.91±0.06、2.20±0.04和2.30±0.06。两组间对应比较除第1d无统计学差异(t=-1.48,P=0.21＞0.05)外,其余均有统计学差异(P＜0.01)。Ⅰ、Ⅱ两组第4d细胞周期(%):G0/G1期分别为62.11±1.15和50.63±0.54,比较有统计学差异(t=12.76,P=0.0061＜0.01);S+G2/M期分别为37.90±1.15和49.36±0.54,比较有统计学差异(t=-12.74,P=0.0061＜0.01);电镜观察:Ⅰ组细胞细胞核浆比例大,核仁较大,细胞器稀少;Ⅱ组细胞核质比例较小,核不规则,核仁较小,胞质中有丰富的细胞器,如核糖体、线粒体、粗面内质网和高尔基复合体等。2、MSCs对PC-3生长的影响。A组细胞第1-7d的光密度值(OD)分别为0.116±0.01、0.208±0.004、0.405±0.04、0.845±0.01、1.404±0.01、1.957±0.01和2.08±0.05;B组细胞第1-7d的OD值分别为0.120±0.02、0.285±0.006、0.617±0.01、1.111±0.03、1.625±0.02、2.277±0.01和2.283±0.01。两组间对应比较除第1d无统计学差异(t=0.07,P=0.797＞0.05)外,其余均有统计学差异(P＜0.01)。A、B两组第4d细胞周期(%):G0/G1期分别为68.54±1.21和56.20±0.78,比较有统计学差异(t=12.13,P)=0.0067＜0.01);S+G2/M期分别为31.46±1.20和43.80±0.77,比较有统计学差异(t=-12.22,P=0.0066＜0.01);电镜观察:A组细胞核质比例较大,核呈椭圆形,仅含1个核仁,染色质分布稀疏,电子密度较低,胞质细胞器稀少;B组细胞核质比例较小,核呈不规则形,有核袋及核突,含2-3个核仁。胞质中有丰富的细胞器,如核糖体、线粒体、粗面内质网和高尔基复合体等。结果显示PC-3细胞与hBMSCs相互促进增殖,其机制是G1期细胞向S期转换加快。最后,本实验探讨了前列腺癌PC-3细胞对hBMSCs成骨分化的影响。收集PC-3细胞上清液作为条件培养基。将hBMSCs分为四组。Ⅰ组:对照组(hBMSCs培养基);Ⅱ组:PC-3条件培养液培养组(含50%PC-3条件培养液的hBMSCs培养基);Ⅲ组:成骨诱导液培养组;Ⅳ组:含PC-3条件培养液的成骨诱导液培养组(含50%PC-3条件培养液的成骨诱导液)。第14d行ALP染色和ALP活性定量检测,第21d行Von Kossa钙染色和钙定量检测。结果:1、ALP活性定量(U/mg protein):第14d各组分别为:0.29±0.03、1.30±0.03、2.13±0.07和3.80±0.03。组间比较有统计学差异(P＜0.01)2、钙沉积定量(μmol/well):第21d各组分别为:0.04±0.01、0.44±0.05、0.98±0.03和1.27±0.04。组间比较有统计学差异(P＜0.01)3、ALP染色:各组细胞染色阳性率和染色强度依次增高。4、Von Kossa钙染色:各组钙结节数依次增多、染色强度依次增高。提示前列腺癌PC-3细胞能促进hBMSCs向成骨细胞分化。