目的:联合应用光遗传操控与CRISPR技术可在时、空、质等多个维度精准调控基因表达水平。组蛋白去甲基化酶KDM5C是表观遗传关键调控因子,涉及多个发育和病理进程,其表达调控对于遗传病病因机制研究及干预治疗等领域都具有重要的研究价值。本研究在CRISPR敲除KDM5C技术体系优化的基础上,开展了光操控CRISPR-dCas9精准调节KDM5C表达体系构建的初步研究。方法:在构建KDM5C基因敲除细胞的研究过程中,我们设计了靶向KDM5C基因的sgRNA,分别利用Goldengate克隆法及经典酶切连接克隆法构建sgRNA重组质粒。经过脂质体转染及TIDE检测sgRNA效率后,我们将质粒pLentiguide-Puro和pLentiCas9-Blast包装入慢病毒并感染细胞,筛选鉴定KDM5C敲除的HEK293T细胞系。在此基础上,我们将光操控 CRISPR激活质粒（pNLS×3-CRY2PHR-P65、pNLS-dCas9-trCIBN 和 pdCas9-sgRNA-KDM5C）共转染 HEK293T 细胞,转染后 48 h 采用单色蓝光（470 nm、3 W/m2）照射细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测KDM5C表达变化。此外,我们还尝试将光操控CRISPR抑制质粒（pNLS ×3-CRY2PHR-KRAB、pNLS-dCas9-trCIBN 和 pdCas9-sgRNA-KDM5C）转染入 HEK293T 细胞,利用实时荧光定量PCR检测其抑制效果。依据HEK293T模型技术条件,我们在PC12细胞中应用光操控CRISPR体系激活Kdm5c基因表达,利用实时荧光定量PCR技术检测NeuN和Nestin等神经分化指标变化;结合光镜观察细胞形态变化,统计突触长度及数量;并通过免疫荧光染色检测MAP2和NeuN等指标变化。结果:首先,我们构建了 Cas9稳定表达的HEK293T细胞系及KDM5C基因敲除的稳筛细胞系。在此过程中,采用Goldengate克隆法构建的sgRNA重组质粒阳性率为60%,比经典酶切连接克隆法（阳性率16%）高出44%。随后我们在HEK293T中应用光操控CRISPR激活体系,实时荧光定量PCR结果显示其表达水平上调5.19±0.52倍。另一方面,我们利用光操控CRISPR抑制体系下调KDM5C基因表达至原有水平的0.14±0.08倍。在此基础上,我们在PC12细胞中利用光操控CRISPR激活体系上调Kdm5c表达1.75±0.11倍,光镜观察结果显示PC12细胞形态变圆。在PC12细胞中添加NGF诱导3天,使用上述光操控激活体系后观察细胞形态,统计结果显示细胞突触长度和数量均显著降低。免疫荧光结果也提示NeuN等神经元样分化指标受到抑制。结论:我们在HEK293T细胞中构建了 KDM5C基因敲除稳筛细胞系。在HEK293T细胞中,我们利用光操控CRISPR体系初步实现了动态调控KDM5C基因表达水平。在PC12细胞中,利用上述激活体系上调Kdm5c表达1.75±0.11倍后,我们观察到细胞神经元样分化指标降低。