研究背景：创伤性脑损伤是一种严重危及人类健康的疾病,有着较高的发病率、致残率和死亡率。全世界每年约有1000多万人遭受各种类型和程度的颅脑损伤。创伤性颅脑损伤不仅导致患者死亡,即使有幸存活的患者也会在伤后遭受不同程度的并发症,包括各种神经功能缺损和运动功能的障碍等。最近数十年来,随着急诊抢救与重症监护设备、技术以及药物的进展,脑损伤患者的生存率得到了较大的改善。不过令人遗憾的是,到目前为止,仍然没有一种药物可以很好的防止颅脑损伤导致的各种长远期的并发症。一系列的研究已经表明,颅脑损伤的损害的严重程度不仅是和原发性创伤相关的,更多的是和继发性损伤密切相关,包括神经炎症反应、脑水肿和血脑屏障的破坏等等。继发性损伤可以从损伤开始后不久一直持续几天、几个月甚至几年,最终导致神经元的死亡或神经退行性疾病的发生。另一方面,原发性颅脑损伤在损伤当时就已经发生,在临床上是无法干预的。因此,目前脑损伤的研究都集中在如何减少继发性颅脑损伤。寻找合适的药物靶点及药物干预继发性颅脑损伤,是改善颅脑损伤患者预后的关键。亚甲蓝是一种噻吩嗪类化合物,具有自身氧化还原的特性。其在临床已经使用了120多年,既往主要用于治疗高铁血红蛋白血症、疟疾、氰化物中毒、心肺转流术和脓毒血症。近年来,亚甲蓝在中枢神经系统中的作用越来越引起大家的重视,亚甲蓝对于缺血性脑卒中、侧索性硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森病、Leber视神经病变和其他神经退行性疾病等都具有潜在的治疗价值。由于颅脑损伤和其他类型的神经系统病变如缺血性脑卒中和退行性神经病变方面有不少共同的病理生理机制,因此,我们推测亚甲蓝在颅脑损伤中也具有同样的治疗价值。本研究拟采用ICR小鼠进行创伤性颅脑损伤的造模,探讨亚甲蓝对创伤性颅脑损伤的神经保护作用并进一步研究其可能的作用机制。第一部分亚甲蓝对创伤性颅脑损伤的神经保护作用研究目的：本研究采用ICR小鼠进行创伤性脑损伤造模,探讨亚甲蓝是否对创伤性颅脑损伤具有神经保护的作用。研究方法：(1)预实验确定亚甲蓝的最佳使用剂量：将小鼠分为5组,分别为假手术组、生理盐水处理组、低剂量亚甲蓝治疗组(0.lmg/kg)、中等剂量亚甲蓝治疗组(l.0mg/kg)和高剂量亚甲蓝治疗组(10mg/kg)。以脑损伤后24小时脑含水量和神经功能缺损评分为依据,确定亚甲蓝的最佳剂量。(2)根据预实验结果,将小鼠分为假手术组、生理盐水处理组和亚甲蓝治疗组。结合文献资料,我们选择伤后24小时及72小时进行神经功能缺损评分、脑损伤体积、脑含水量和神经元数量的检测；在伤后14天进行神经功能缺损评分和脑损伤体积的测定。(3)相关指标评估的方法：采用改良的神经功能缺损评分进行神经功能评估；采用干湿重量法测定脑含水量；采用免疫组化NeuN染色,用Image-Pro Plus软件检测神经元的数量；采用连续切片HE染色,用Image tool软件计算脑损伤体积。研究结果：(1)预实验结果表明：脑损伤后损伤侧大脑半球脑含水量及神经功能缺损较假手术组明显增高(P<0.05)。与生理盐水处理组比较,采用l.Omg/kg亚甲蓝治疗后能显著降低伤后24小时的神经功能缺损评分和脑含水量(P<0.05),亚甲蓝其他两个剂量与生理盐水组比较都无统计学差异(P>0.05)。因此确定使用亚甲蓝1.0mg/kg为我们正式实验的剂量。(2)脑含水量的检测结果表明,亚甲蓝可以显著降低ICR小鼠创伤性脑损伤后24小时损伤侧大脑半球的脑含水量(P<0.05),而对侧大脑半球、脑干、小脑等部位的脑含水量无统计学差异(P>0.05)。同时我们发现在伤后72小时两组小鼠在各个部位的脑含水量无统计学差异(P>0.05)。(3)神经元的免疫组化检测表明,采用亚甲蓝治疗的小鼠在伤后24小时及72小时损伤区的神经元数量要显著高于生理盐水处理组,两者存在着统计学的差异(P<0.05)。(4)神经功能缺损评分表明,与生理盐水处理组相比,采用亚甲蓝治疗能降低小鼠脑损伤后24小时和72小时的神经功能缺损评分,差异有统计学意义(P<0.05)。而在脑损伤后14天,两组小鼠的神经功能缺失评分无显著差异(P>0.05)。(5)脑损伤体积检测结果表明,与生理盐水组比较,亚甲蓝治疗减少了脑损伤后24小时、72小时和14天脑损伤的体积(P<0.05)。结论：亚甲蓝治疗可以降低创伤性脑损伤的神经功能缺损评分,降低创伤性脑损伤引起的脑水肿,减少脑损伤的体积,阻止创伤性脑损伤后神经元的死亡。第二部分亚甲蓝对创伤性颅脑损伤的神经保护作用机制探讨研究目的：探讨亚甲蓝对创伤性颅脑损伤神经保护作用的可能机制。研究方法：(1)我们将实验小鼠分为假手术组、生理盐水处理组和亚甲蓝治疗组。结合文献资料,在伤后24小时及72小时评估自噬激活情况、促炎细胞因子水平和小胶质细胞激活情况；在伤后14天评估小胶质细胞激活情况。(2)相关指标评估的方法：免疫组化Beclin-1染色,Western Blot检测Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ来评估自噬激活情况；Western Blot来检测炎症因子IL-6、 ILlβ的表达量； Iba-1免疫组化染色来检测小胶质细胞激活情况。(3) mTOR/p70S6K通路中相关蛋白的变化情况采用Western Blot检测。研究结果：(1)脑损伤后自噬显著激活；与生理盐水处理组比较,亚甲蓝治疗促进了创伤性脑损伤后24小时及72小时自噬的发生,表现为Beclin-1表达的上调和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的增加(P<0.05)。(2)脑损伤后促炎细胞因子IL-6、IL1β的释放增加；与生理盐水处理组比较,亚甲蓝显著抑制了脑损伤后24小时及72小时IL-6、IL1β的表达(P<0.05)。(3)小胶质细胞在脑损伤后72小时和14天激活明显(P<0.05)；与生理盐水处理组相比,亚甲蓝治疗抑制了创伤性脑损伤后72小时及14天小胶质细胞的激活(P<0.05)。(4)脑损伤后1nTOR/p70S6K通路激活,表现为磷酸化的mTOR和磷酸化的p70S6K表达增加(P<0.05)。而与生理盐水处理组相比,亚甲蓝治疗后显著抑制了mTOR/p70S6K通路中磷酸化的mTOR及磷酸化的p70S6K蛋白的表达(P<0.05),而对于总的mTOR及总的p70S6K蛋白的水平无明显的影响(P>0.05)。结论：(1)亚甲蓝治疗可以通过减少创伤性脑损伤后促炎细胞因子的释放,抑制小胶质细胞的激活及促进自噬的发生起到神经保护作用。(2)结合文献资料和以上实验结果,我们认为亚甲蓝可能是通过抑制mTOR/p70S6K通路相关蛋白的激活,从而起到了抑制神经炎症反应和促进自噬的作用。