玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的功能研究

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玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea Wize)是一种重要的昆虫病原真菌,在生物防治中有重要的应用价值。本论文利用DNA步移方法扩增获得了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的DNA和cDNA全长,通过基因敲除和回补获得敲除菌株和回补菌株。在比较亲本菌株和敲除菌株的生物学特性、代谢产物的生化特性以及致病力的基础上,研究了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的功能,明确了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因与菌株致病力间的关系。具体研究包括以下几个方面:(1)玫烟色棒束孢Ifcdp1基因全长的扩增及序列分析。利用DNA步移方法扩增了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的DNA全长,在GenBank中登录号为KU519628。经与cDNA序列比对分析表明:玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的编码序列长度为1140 bp,DNA序列中含有大小分别为65 bp,59 bp和59 bp的内含子,在基因序列上游-508bp处有真核生物的基本启动子序列TATA-盒;Southern Blot结果显示Ifcdp1在菌株的基因组中为单拷贝,可编码380个氨基酸,含有肽酶S8-S53超家族的活性位点天冬氨酸(Asp)-组氨酸(His)-丝氨酸(Ser)催化三联体,预测分子量为39.3 kDa,等电点为8.72。(2)玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的敲除与回补。构建了Ifcdp1基因的敲除载体和互补载体,通过农杆菌介导将带敲除载体的质粒pPB-5’-flanking和p BT-3’-flanking导入野生菌株中、敲除玫烟色棒束孢Ifcdp1基因而获得敲除菌株,将带互补载体的质粒pBen-Ifcdp1导入敲除菌株中回补Ifcdp1基因而获得回补菌株,PCR鉴定进一步确认获得敲除和回补菌株。(3)敲除Ifcdp1基因对玫烟色棒束孢菌株生物学特性的影响。敲除Ifcdp1基因对菌株的菌丝生长没有影响,在相同温度和培养基下,敲除菌株(MT)与野生菌株(WT)、回补菌株(CT)的菌丝生长速率差异不显著。敲除Ifcdp1基因显著影响菌株的产孢量,在相同培养基上培养相同时间,MT菌株的产孢量只有WT菌株的50%。敲除Ifcdp1基因不影响菌株代谢产物中总蛋白酶的活性,但会导致Pr1蛋白酶的活性显著降低:在CZB培养液中,MT菌株的总蛋白酶活性与WT、CT菌株差异不显著;在CZB、PDB、SDBY培养液中培养24-48h时,MT菌株发酵液中的Pr1蛋白酶活性显著低于WT菌株的Pr1蛋白酶活性(P<0.05)。(4)敲除Ifcdp1基因对玫烟色棒束孢菌株致病力的影响。以烟粉虱和小菜蛾为生测对象,对CT、MT和WT菌株进行了生物测定。以烟粉虱若虫为生测对象,MT菌株第6d的致死中浓度LC50(2.26×106孢子/ml)明显高于WT的LC50(5.11×105孢子/ml),MT菌株(浓度为1×106孢子/mL)的致死中时间LT50(176h)明显长于WT的LT50(130h)值。而以小菜蛾为生测对象时,MT菌株第3d的致死中浓度LC50(1.59×105孢子/ml)明显低于WT的LC50(1.03×106孢子/ml),MT菌株(浓度为1×106孢子/mL)的致死中时间LT50(62h)明显短于WT的LT50(78h)值。表明Ifcdp1基因的敲除导致玫烟色棒束孢对烟粉虱的致病力减弱,对小菜蛾的致病力增加。经WT、MT菌株处理后烟粉虱成虫的产卵量显著降低,Ifcdp1基因敲除后玫烟色棒束孢对烟粉虱成虫产卵量的影响显著减弱。
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