第一部分ENT1在颞叶癫痫患者及点燃动物模型中的表达目的：观察ENT1在难治性颞叶癫痫患者颞叶脑组织的表达及氯化锂-匹鲁卡品点燃癫痫大鼠海马中的时空表达关系。方法：1.病人：用随机的方法从课题组收集并建立的难治性颞叶癫痫患者术后脑组织库中抽取15例脑组织，用Weatern blot方法检测ENT1的表达，并与15例年龄、性别匹配的脑外伤组织标本进行对照。2.动物：将雄性成年SD大鼠（体重200g左右）随机分为正常对照组（n=5）与癫痫组（6h、24h、72h和1w四个时间点，n=5×4），经腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品，建立癫痫实验动物模型，用Weatern blot、免疫组化及免疫荧光检测ENT1在癫痫患者颞叶和癫痫鼠海马组织中表达。结果：1.通过Western blot检测，显示外伤患者的脑组织及难治性颞叶癫痫患者的脑组织中ENT1均有表达，然而，在癫痫患者的脑组织中ENT1的免疫印迹强度明显增强(1.18±0.15)，与非癫痫患者(0.50±0.10)相比较，其蛋白含量的差异有统计学意义（p＜0.01）。2.通过Western blot检测，显示正常组的大鼠海马组织中检测到ENT1有基础水平的表达；在匹罗卡品诱发的癫痫大鼠海马组织中，在癫痫发作后的6h的标本就发现ENT1的水平升高，24h达到高峰，且在72h和1w这两个时间点的蛋白量水平仍处于升高水平。在癫痫组中所检测到的各个时间点的ENT1的蛋白含量与正常对照组的相比较，其差异有统计学意义（p＜0.01）；此外，通过免疫组化和免疫荧光双重标记技术，发现在癫痫大鼠海马中，ENT1在神经元和星形胶质细胞的胞浆内均有表达。结论：在癫痫患者脑组织和实验大鼠点燃模型海马中ENT1的蛋白表达水平均明显升高，该情况提示ENT1可能参与了癫痫的发生与发展过程。第二部分在体实验检测ENT1在大鼠癫痫发作中的功能目的：了解抑制ENT1对实验大鼠癫痫样行为学的影响。方法：将ENT1选择性抑制剂硝基苯硫嘌呤核苷（50μM）及其溶剂二甲亚砜，通过立体定位及微管将其注射入大鼠双侧海马CA1区，观察硝基苯硫嘌呤核苷抑制ENT1后对大鼠癫痫发作的影响情况。1.成年雄性SD大鼠，随机分为正常对照（Control）组（n=9）、溶剂对照（vehicle）组（n=9）和硝基苯硫嘌呤核苷组（n=9）；各组在腹腔注射匹鲁卡品前分别微管注射生理盐水、二甲亚砜及硝基苯硫嘌呤核苷。2.腹腔注射匹鲁卡品后建模，观察首次癫痫发作的潜伏期改变及不同时间段Racine评分的情况。结果： Racine评分达到4级及以上者视为癫痫发作，正常对照组的潜伏期为24.56±5.83min，溶剂对照组的为23.89±5.93min，硝基苯硫嘌呤核苷组的为55.89±8.74min，Racine评分在注射匹罗卡品后10min、20min及30min三个时间点，正常对照组分别2.67±0.50、3.67±0.50及4.78±0.44；溶剂对照组分别为2.56±0.53、3.89±0.60及4.78±0.44；硝基苯硫嘌呤核苷组分别为0.67±0.50、1.78±0.44及2.89±0.33。潜伏期及Racine评分于正常对照及溶剂对照两组之间的比较差异无统计学意义（P＞0.05），与上述两组比较，硝基苯硫嘌呤核苷组的潜伏期明显延长，且大鼠腹腔注射匹鲁卡品后个时间点的Racine评分明显降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论：有效剂量硝基苯硫嘌呤核苷干预可明显明显延长匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫发作潜伏期以及降低癫痫发作强度，换言之，选择性抑制ENT1功能，可以有效地抑制实验大鼠的癫痫发作。第三部分离体实验检测ENT1在癫痫大鼠海马脑片中的功能目的：通过全细胞膜片钳技术，观察癫痫大鼠海马脑片电生理学指标的变化以及ENT1选择性抑制剂硝基苯硫嘌呤核苷的干预情况，探讨ENT1在抗癫痫发作中的作用。方法：制备成年大鼠海马脑片，随机选择正常成年大鼠及造模成功的癫痫大鼠（根据第一部分实验结果，选择ENT1表达高峰的时间点24h的模型鼠），癫痫大鼠海马脑片每个指标检测完之后，均需灌流ENT1选择性抑制剂硝基苯硫嘌呤核苷（100nM）。全细胞膜片钳技术检测正常鼠及癫痫鼠海马脑片的兴奋性改变情况:动作电位,计算其频率的变化情况；进而检测诱发的总的兴奋性突触后电流及NMDA和AMPA受体介导的兴奋性突触后电流，观察其幅值的的变化情况；最后检测自发的微小的兴奋性突触后电流，检测其频率和幅值的改变情况。结果：1.成功制备适于膜片钳全细胞记录的成年大鼠海马脑片。2.计算动作电位频率：正常大鼠海马脑片可偶尔记录到动作电位的产生，癫痫大鼠海马脑片的动作电位频率明显加快（125±8.86/min），经过灌流100nM硝基苯硫嘌呤核苷后，动作电位频率明显减弱（25。2±5.97/min， P＜0.01），再次使用人工脑脊液洗脱后，动作电位频率回升显著（98.6±6.47/min， P＜0.01）。此外，100nM硝基苯硫嘌呤核苷也可使得单位时间内，相同强度的注入电流所诱发出来的动作电位个数减少（P＜0.01）。3.检测硝基苯硫嘌呤核苷模拟腺苷的作用：与正常大鼠海马脑片（0.49±0.06nA）相比,总的兴奋性突触后电流的幅值明显升高(1.44±0.05nA，P＜0.01)。灌流腺苷(25μM)可以明显降低总的兴奋性突出后电流的幅值,然而，加入腺苷A1受体抑制剂DPCPX(10μM)又可以使得幅值回升。100nM硝基苯硫嘌呤核苷可以模拟腺苷的作用。此外，腺苷对总的兴奋性突触后电流的抑制作用是浓度依赖性的。在50M腺苷作用时，对总的兴奋性突出后电流的抑制更强,再加入100nM硝基苯硫嘌呤核苷后，抑制作用有叠加的效果。然而，当腺苷的浓度达到饱和时(100M),再加入100nM硝基苯硫嘌呤核苷后，却未再见到叠加效果。4.检测硝基苯硫嘌呤核苷抑制兴奋性神经递质的作用：同正常鼠脑片相比较，自发的微小兴奋性突触后电流的频率和幅值以及NMDAR和AMPAR介导的电流在癫痫鼠的脑片中均明显升高(P＜0.01)。100nM硝基苯硫嘌呤核苷可以明显减弱癫痫鼠脑片的自发的微小兴奋性突触后电流的频率(P＜0.01)，但是对幅值却无明显影响(P＞0.05)。为进一步确定是NMDAR还是AMPAR介导的作用，发现使用100nM硝基苯硫嘌呤核苷可以减弱癫痫鼠脑片的NMDAR和AMPAR介导兴奋性突出后电流的幅值(P＜0.01)。结论：1.硝基苯硫嘌呤核苷可降低癫痫大鼠海马脑片CA1区锥体神经元的动作电位频率，选择性抑制ENT1功能，可以有效降低癫痫大鼠海马离体脑片的神经元的兴奋性。2.硝基苯硫嘌呤核苷对兴奋性突触后电流的影响是通过腺苷A1受体介导的，选择性抑制ENT1功能，是通过抑制腺苷A1受体的功能而抑制神经元兴奋性。3.硝基苯硫嘌呤核苷选择性地抑制自发性的微小兴奋性突触后电流频率以及NMDAR和AMPAR介导的兴奋性突出后电流，提示选择性抑制ENT1功能，是通过影响突触前结构谷氨酸能神经递质的释放而起效。第四部分探究ENT1参与癫痫发作的潜在机制目的：探讨ENT1参与癫痫发作的潜在机制。方法：将ENT1选择性抑制剂硝基苯硫嘌呤核苷（NBTI,50μM）及其溶剂二甲亚砜(DMSO)和生理盐水，通过立体定位及微管将其注射入大鼠双侧海马CA1区，观察硝基苯硫嘌呤核苷抑制ENT1后对cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平的影响情况。1.选择成年雄性SD大鼠（200g左右），随机分为正常对照组（n=5）、癫痫组（24h）（n=5）、DMSO组（n=5）及NBTI组（n=5）。3.Weatern blot检测CREB磷酸化水平在上述不同组别海马组织中的表达情况。结果：癫痫大鼠海马内的CREB磷酸化水平（1.05±0.11）较正常大鼠（0.44±0.06）的明显增强，差异有统计学意义（p＜0.01）。提前海马内注射50μM NBTI，再将大鼠腹腔内注射皮罗卡品建癫痫模型，可发现海马内的CREB磷酸化水平（0.47±0.07）明显被抑制，与癫痫组的磷酸化水平相比较，差异有统计学意义（p＜0.01）。此外，提前海马内注射溶剂DMSO，再建模，对大鼠海马内CREB的磷酸化水平无明显影响（1.09±0.12），与模型组相比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。结论：硝基苯硫嘌呤核苷抑制ENT1后，大鼠海马中CREB磷酸化水平显著下降，该情况提示CREB可能参与了ENT1在癫痫发作中的作用。