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研究背景
阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一种进行性的神经退行性疾病，以认知障碍和行为损伤为主要临床症状，病理特征主要表现为脑中β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的细胞外老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成的细胞内神经原纤维缠结和神经元缺失等。目前最受认可的淀粉样蛋白假说认为，导致AD一系列病理生理改变的中心触发因素为Aβ聚集，可诱发神经元损伤和死亡、突触缺失、神经炎症和tau蛋白过度磷酸化等，这些病理过程反过来又进一步促进Aβ沉积，从而形成一种级联式放大效应，最终导致认知功能障碍。
依据AD的发病机制和淀粉样蛋白假说，以Aβ聚集引发的神经毒性反应为目标寻找治疗AD的潜在药物是一个很有前景的研究方向，也是当前的热点和难点。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，本课题组前期研究证实黄芪甲苷对不同痴呆模型的学习记忆能力具有一定的改善作用，但其作用机制还不完全清楚。
过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferators-activatedreceptorgamma，PPARγ)是核受体超家族成员之一，主要调控目标基因的转录，参与体内脂代谢、糖稳态、炎症反应、凋亡等多种生理反应。PPARγ表达或激活在神经退行性病变中发挥重要的保护作用，PPARγ激动剂能改善AD患者的记忆和认知能力，PPARγ可能成为AD治疗的新靶点。此外，BDNF已被证实与AD的发病及进展密切相关，其表达受PPARγ的调控，BDNF通过TrkB受体在突触可塑性和学习记忆中发挥重要的调节作用。
本课题拟在Aβ1-42诱导的AD样体内外模型中进一步验证黄芪甲苷的神经保护作用，并深入探讨其发挥作用的潜在机制。
第一部分黄芪甲苷对Aβ1-42诱导的小鼠AD样行为的改善作用及其机制
目的
研究AS-Ⅳ对小鼠AD样行为的影响，并从PPARγ-BDNF/TrkB信号通路探讨其作用机制。
方法
5-6周龄雄性C57BL/6小鼠被随机分为假手术组、Aβ1-42注射组、AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)给药组、PPARγ抑制剂组和阳性对照组。除假手术组和阳性对照组外，其余各组小鼠每天灌胃给予AS-Ⅳ一次，持续一周后行双侧海马注射Aβ1-42。术后第二天，阳性对照组灌胃给予多奈哌齐5mg/kg，PPARγ抑制剂组灌胃给予AS-Ⅳ20mg/kg和腹腔注射给予GW96621mg/kg，AS-Ⅳ低、中、高剂量组如前分别灌胃给予AS-Ⅳ10、20和40mg/kg，假手术组和Aβ1-42注射组灌胃等体积生理盐水，每天给药一次，持续四周。给药完毕后评估小鼠认知功能和AD样表型的病理学改变。小鼠认知功能相关的行为学测试分别为：Morris水迷宫检测小鼠空间学习和记忆，新物体识别实验观察小鼠的辨识记忆，条件化恐惧记忆实验评价小鼠的恐惧记忆；行为学测试结束后，分离小鼠海马组织，尼氏染色观察海马神经元的损伤程度；酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunoserbent Assay， ELISA)检测内源性Aβ1-42水平和IL-1β、IL-6和TNF-α的含量；免疫组化检测BDNF和PPARγ蛋白的阳性表达；Golgi-Cox染色测定神经元树突棘密度；透射电镜观察突触超微结构和海马神经元凋亡情况；RT-qPCR检测BDNF和PPARγ的mRNA水平；免疫荧光检测PPARγ和BDNF，SYN和MAP-2，PPARγ和GFAP的共表达以及PSD95、SYN和GAP43蛋白的阳性表达；Westernblotting检测t-tau、p-tau、BDNF、t-TrkB、p-TrkB、PPARγ、GFAP、Cleavedcaspase-3蛋白和突触相关蛋白PSD95、SYN、GAP43、Arc的表达；TUNEL染色检测海马神经元凋亡程度。
结果
1.AS-Ⅳ改善Aβ1-42诱导的小鼠认知功能障碍
Morris水迷宫实验结果显示注射Aβ1-42使小鼠的空间学习和记忆显著下降；新物体识别实验结果显示注射Aβ1-42使小鼠的辨识记忆显著下降；条件化恐惧记忆实验结果显示注射Aβ1-42使小鼠的线索性恐惧记忆和情景性恐惧记忆均显著下降。小鼠经AS-Ⅳ给药后，Morris水迷宫定位航行试验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)能剂量依赖性地逆转Aβ1-42注射的小鼠寻找平台的潜伏期；空间探索试验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)能剂量依赖性地增加Aβ1-42注射的小鼠在目标象限的停留时间及游泳距离，改善Aβ1-42注射的小鼠空间学习和记忆；新物体识别实验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)在一定程度上能提高Aβ1-42注射的小鼠辨识记忆，但差异无统计学意义。条件化恐惧记忆实验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)能剂量依赖性地逆转Aβ1-42注射的小鼠僵立时间，恢复情景性恐惧记忆和线索性恐惧记忆。
2.AS-Ⅳ减轻Aβ1-42诱导的海马区病理改变
尼氏染色结果显示，相较Aβ1-42注射组，AS-Ⅳ给药组小鼠海马神经细胞数量增多，形态规则，排列相对整齐，且尼氏小体数量明显增多，神经元损伤程度减轻；Aβ1-42注射没有导致小鼠海马内源性Aβ1-42含量的显著性增加，但能引起tau蛋白磷酸化水平显著上升；而AS-Ⅳ能显著逆转Aβ1-42注射导致的小鼠tau蛋白磷酸化水平增加。
3.AS-Ⅳ减轻Aβ1-42诱导的海马区突触毒性
免疫荧光和Westernblotting检测结果显示与假手术组相比，Aβ1-42注射组小鼠海马区突触特异性蛋白PSD95、SYN、GAP43的表达均显著下降，AS-Ⅳ显著增加Aβ1-42注射的小鼠海马PSD95、SYN和GAP43蛋白的表达；但Arc蛋白的表达在各组小鼠间没有显著性差异。MAP-2和SYN免疫荧光共标结果显示与假手术组相比，Aβ1-42注射组小鼠海马神经元MAP-2阳性细胞数明显减少，神经突起破坏明显，树突排列紊乱，突起长度明显缩短，同时伴有SYN蛋白的阳性表达明显减少；AS-Ⅳ能明显增加Aβ1-42注射的小鼠海马MAP-2蛋白表达的同时伴有SYN蛋白的表达也明显上升。Golgi-Cox染色结果显示Aβ1-42注射组小鼠海马神经元树突棘密度显著降低；AS-Ⅳ能显著增加Aβ1-42注射的小鼠海马神经元树突棘密度。透射电镜观察结果显示Aβ1-42注射组小鼠海马区显微结构模糊，突触数量明显较少，突触间隙融合不清，突触囊泡减少；AS-Ⅳ能改善Aβ1-42注射的小鼠海马区突触结构损伤，减轻突触毒性。
4.AS-Ⅳ促进海马神经元PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降
RT-qPCR、Westernblotting和免疫组化检测结果显示Aβ1-42注射组小鼠海马BDNF和PPARγmRNA和蛋白水平均显著下降；AS-Ⅳ能显著增加Aβ1-42注射的小鼠海马PPARγ和BDNFmRNA和蛋白表达，同时上调TrkB蛋白的磷酸化水平。此外，PPARγ和BDNF免疫荧光共标观察结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马PPARγ表达下降的同时伴有BDNF的表达也明显下降；AS-Ⅳ能明显增加Aβ1-42注射的小鼠海马区PPARγ表达的同时伴有BDNF表达的增加。此外，在Aβ1-42注射的小鼠中，PPARγ抑制剂GW9662和AS-Ⅳ联合给药不但阻断了AS-Ⅳ对PPARγ表达的影响，同时也阻断了AS-Ⅳ对BDNF表达的影响。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进海马神经元PPARγ表达，继而抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降并激活BDNF/TrkB信号通路。
5.AS-Ⅳ促进海马神经元PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的神经炎症
ELISA检测结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著升高；AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42诱导的小鼠海马IL-1β、IL-6和TNF-α的含量增加；PPARγ和GFAP免疫荧光共标及Westernblotting检测结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马PPARγ表达显著减少的同时伴有GFAP表达的显著增加；AS-Ⅳ上调Aβ1-42诱导的小鼠海马PPARγ表达的同时伴有GFAP表达显著下降；PPARγ抑制剂GW9662与AS-Ⅳ联合用药则能阻断AS-Ⅳ对Aβ1-42诱导的小鼠海马IL-1β、IL-6、TNF-α、PPARγ和GFAP表达的影响。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进海马PPARγ表达，继而抑制海马区胶质细胞的增生，降低促炎因子的表达，减轻Aβ1-42诱导的神经炎症。
6.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的海马神经元凋亡
TUNEL染色、透射电镜和Westernblotting检测结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马区神经元凋亡形态明显，Cleavedcaspase-3蛋白表达显著上升；AS-Ⅳ能显著下调Aβ1-42诱导的小鼠海马神经元Cleavedcaspase-3蛋白的表达，抑制神经元凋亡。
本章小结
AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，进而上调BDNF水平并激活BDNF/TrkB信号通路，修复突触损伤，抑制海马区胶质细胞的活化，降低促炎因子的表达，减轻神经炎症反应，阻止海马神经元凋亡，改善Aβ1-42诱导的小鼠认知功能障碍。
第二部分黄芪甲苷对Aβ1-42诱导的HT-22细胞的保护作用及其机制
目的
研究AS-Ⅳ对Aβ1-42诱导的HT-22细胞的影响及其机制。
方法
以10μMAβ1-42损伤HT-22细胞48h建立AD样细胞模型。采用MTT法检测细胞存活率；LDH法检测细胞损伤度；台盼蓝染料排斥实验检测细胞死亡率；RT-qPCR检测BDNF和PPARγmRNA水平；采用PPARγRNAi技术和PPARγ特异性抑制剂(GW9662)处理，Westernblotting检测BDNF、t-TrkB、p-TrkB、PPARγ和Cleavedcaspase-3蛋白的表达；ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α的含量；流式细胞术检测细胞内活性氧的水平；DAPI染色荧光显微镜和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡程度。
结果
1.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞毒性
MTT检测结果表明AS-Ⅳ在5-100μM浓度范围内能显著增加Aβ1-42诱导的细胞存活率，且呈量效依赖性。当AS-Ⅳ浓度达到500μM时，与Aβ1-42处理组比较，细胞存活率差异不显著。LDH法检测结果表明Aβ1-42处理后细胞损伤程度显著增加；AS-Ⅳ(25、50、100μM)预处理后细胞损伤程度显著减轻；台盼蓝染色后镜下可见Aβ1-42处理组细胞死亡率显著增加，AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42诱导的细胞损伤和死亡。
2.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞BDNF水平下降
RT-qPCR及Westernblotting检测结果显示HT-22细胞经10μMAβ1-42作用后，BDNFmRNA和蛋白表达及TrkB的磷酸化水平均显著降低；与外源性BDNF作用效应一致，AS-Ⅳ能显著上调Aβ1-42诱导的BDNFmRNA和蛋白表达及TrkB的磷酸化水平，且呈浓度依赖性；此外，单用AS-Ⅳ也能显著促进正常HT-22细胞(未加Aβ1-42处理)中BDNF蛋白的表达。上述结果表明AS-Ⅳ能抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降并激活BDNF/TrkB信号通路。
3.AS-Ⅳ促进HT-22细胞PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降
Westernblotting检测结果发现在正常HT-22细胞中干扰PPARγ，阻断其表达后，BDNF蛋白水平亦显著下降；在Aβ1-42诱导的HT-22细胞中，干扰PPARγ或使用PPARγ抑制剂GW9662阻断其表达后均能显著逆转AS-Ⅳ对BDNF蛋白表达的影响；此外，HT-22细胞经Aβ1-42损伤后PPARγmRNA和蛋白水平均显著下降；AS-Ⅳ能显著上调Aβ1-42诱导的PPARγmRNA和蛋白水平；同时，单用AS-Ⅳ也能促进正常HT-22细胞(未加Aβ1-42处理)中PPARγ蛋白的表达。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，进而抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降。
4.AS-Ⅳ促进HT-22细胞PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的炎症反应
ELISA检测结果显示HT-22细胞经10μMAβ1-42作用后，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著升高；AS-Ⅳ能显著降低Aβ1-42诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，呈浓度依赖性；PPARγ抑制剂GW9662能显著逆转AS-Ⅳ这一效应。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，继而降低促炎因子表达，抑制Aβ1-42诱导的炎症反应。
5.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞氧化性损伤和凋亡
流式细胞仪检测结果显示Aβ1-42诱导了HT-22细胞内活性氧水平的显著升高；与NAC作用效应一致，AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42所致的HT-22细胞氧化性损伤；
此外，与AS-Ⅳ作用效应一致，外源性BDNF也能显著减轻Aβ1-42诱导的神经毒性；而PPARγ抑制剂GW9662显著逆转AS-Ⅳ对Aβ1-42诱导的HT-22细胞存活率的促进作用。DAPI染色、AnnexinV-FITC/PI双染和Westernblotting检测结果进一步表明Aβ1-42诱导了HT-22细胞的凋亡；与外源性BDNF作用效应一致，AS-Ⅳ能显著下调Aβ1-42诱导的Cleavedcaspase-3蛋白的表达，抑制细胞凋亡；而PPARγ抑制剂GW9662显著逆转AS-Ⅳ的抗凋亡效应。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的细胞凋亡。
本章小结
AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞损伤、炎症反应和凋亡，该作用可能与其促进PPARγ表达，进而上调BDNF水平并激活BDNF/TrkB信号通路有关。
结论
在Aβ1-42处理的小鼠海马神经细胞HT-22和C57BL/6小鼠中，AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，进而上调BDNF水平并激活BDNF/TrkB信号通路，修复突触损伤，减轻神经炎症，抑制海马神经元损伤和凋亡，从而改善认知功能障碍，发挥神经保护作用。
阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一种进行性的神经退行性疾病，以认知障碍和行为损伤为主要临床症状，病理特征主要表现为脑中β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的细胞外老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成的细胞内神经原纤维缠结和神经元缺失等。目前最受认可的淀粉样蛋白假说认为，导致AD一系列病理生理改变的中心触发因素为Aβ聚集，可诱发神经元损伤和死亡、突触缺失、神经炎症和tau蛋白过度磷酸化等，这些病理过程反过来又进一步促进Aβ沉积，从而形成一种级联式放大效应，最终导致认知功能障碍。
依据AD的发病机制和淀粉样蛋白假说，以Aβ聚集引发的神经毒性反应为目标寻找治疗AD的潜在药物是一个很有前景的研究方向，也是当前的热点和难点。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，本课题组前期研究证实黄芪甲苷对不同痴呆模型的学习记忆能力具有一定的改善作用，但其作用机制还不完全清楚。
过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferators-activatedreceptorgamma，PPARγ)是核受体超家族成员之一，主要调控目标基因的转录，参与体内脂代谢、糖稳态、炎症反应、凋亡等多种生理反应。PPARγ表达或激活在神经退行性病变中发挥重要的保护作用，PPARγ激动剂能改善AD患者的记忆和认知能力，PPARγ可能成为AD治疗的新靶点。此外，BDNF已被证实与AD的发病及进展密切相关，其表达受PPARγ的调控，BDNF通过TrkB受体在突触可塑性和学习记忆中发挥重要的调节作用。
本课题拟在Aβ1-42诱导的AD样体内外模型中进一步验证黄芪甲苷的神经保护作用，并深入探讨其发挥作用的潜在机制。
第一部分黄芪甲苷对Aβ1-42诱导的小鼠AD样行为的改善作用及其机制
目的
研究AS-Ⅳ对小鼠AD样行为的影响，并从PPARγ-BDNF/TrkB信号通路探讨其作用机制。
方法
5-6周龄雄性C57BL/6小鼠被随机分为假手术组、Aβ1-42注射组、AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)给药组、PPARγ抑制剂组和阳性对照组。除假手术组和阳性对照组外，其余各组小鼠每天灌胃给予AS-Ⅳ一次，持续一周后行双侧海马注射Aβ1-42。术后第二天，阳性对照组灌胃给予多奈哌齐5mg/kg，PPARγ抑制剂组灌胃给予AS-Ⅳ20mg/kg和腹腔注射给予GW96621mg/kg，AS-Ⅳ低、中、高剂量组如前分别灌胃给予AS-Ⅳ10、20和40mg/kg，假手术组和Aβ1-42注射组灌胃等体积生理盐水，每天给药一次，持续四周。给药完毕后评估小鼠认知功能和AD样表型的病理学改变。小鼠认知功能相关的行为学测试分别为：Morris水迷宫检测小鼠空间学习和记忆，新物体识别实验观察小鼠的辨识记忆，条件化恐惧记忆实验评价小鼠的恐惧记忆；行为学测试结束后，分离小鼠海马组织，尼氏染色观察海马神经元的损伤程度；酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunoserbent Assay， ELISA)检测内源性Aβ1-42水平和IL-1β、IL-6和TNF-α的含量；免疫组化检测BDNF和PPARγ蛋白的阳性表达；Golgi-Cox染色测定神经元树突棘密度；透射电镜观察突触超微结构和海马神经元凋亡情况；RT-qPCR检测BDNF和PPARγ的mRNA水平；免疫荧光检测PPARγ和BDNF，SYN和MAP-2，PPARγ和GFAP的共表达以及PSD95、SYN和GAP43蛋白的阳性表达；Westernblotting检测t-tau、p-tau、BDNF、t-TrkB、p-TrkB、PPARγ、GFAP、Cleavedcaspase-3蛋白和突触相关蛋白PSD95、SYN、GAP43、Arc的表达；TUNEL染色检测海马神经元凋亡程度。
结果
1.AS-Ⅳ改善Aβ1-42诱导的小鼠认知功能障碍
Morris水迷宫实验结果显示注射Aβ1-42使小鼠的空间学习和记忆显著下降；新物体识别实验结果显示注射Aβ1-42使小鼠的辨识记忆显著下降；条件化恐惧记忆实验结果显示注射Aβ1-42使小鼠的线索性恐惧记忆和情景性恐惧记忆均显著下降。小鼠经AS-Ⅳ给药后，Morris水迷宫定位航行试验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)能剂量依赖性地逆转Aβ1-42注射的小鼠寻找平台的潜伏期；空间探索试验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)能剂量依赖性地增加Aβ1-42注射的小鼠在目标象限的停留时间及游泳距离，改善Aβ1-42注射的小鼠空间学习和记忆；新物体识别实验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)在一定程度上能提高Aβ1-42注射的小鼠辨识记忆，但差异无统计学意义。条件化恐惧记忆实验结果显示AS-Ⅳ(10、20、40 mg/kg)能剂量依赖性地逆转Aβ1-42注射的小鼠僵立时间，恢复情景性恐惧记忆和线索性恐惧记忆。
2.AS-Ⅳ减轻Aβ1-42诱导的海马区病理改变
尼氏染色结果显示，相较Aβ1-42注射组，AS-Ⅳ给药组小鼠海马神经细胞数量增多，形态规则，排列相对整齐，且尼氏小体数量明显增多，神经元损伤程度减轻；Aβ1-42注射没有导致小鼠海马内源性Aβ1-42含量的显著性增加，但能引起tau蛋白磷酸化水平显著上升；而AS-Ⅳ能显著逆转Aβ1-42注射导致的小鼠tau蛋白磷酸化水平增加。
3.AS-Ⅳ减轻Aβ1-42诱导的海马区突触毒性
免疫荧光和Westernblotting检测结果显示与假手术组相比，Aβ1-42注射组小鼠海马区突触特异性蛋白PSD95、SYN、GAP43的表达均显著下降，AS-Ⅳ显著增加Aβ1-42注射的小鼠海马PSD95、SYN和GAP43蛋白的表达；但Arc蛋白的表达在各组小鼠间没有显著性差异。MAP-2和SYN免疫荧光共标结果显示与假手术组相比，Aβ1-42注射组小鼠海马神经元MAP-2阳性细胞数明显减少，神经突起破坏明显，树突排列紊乱，突起长度明显缩短，同时伴有SYN蛋白的阳性表达明显减少；AS-Ⅳ能明显增加Aβ1-42注射的小鼠海马MAP-2蛋白表达的同时伴有SYN蛋白的表达也明显上升。Golgi-Cox染色结果显示Aβ1-42注射组小鼠海马神经元树突棘密度显著降低；AS-Ⅳ能显著增加Aβ1-42注射的小鼠海马神经元树突棘密度。透射电镜观察结果显示Aβ1-42注射组小鼠海马区显微结构模糊，突触数量明显较少，突触间隙融合不清，突触囊泡减少；AS-Ⅳ能改善Aβ1-42注射的小鼠海马区突触结构损伤，减轻突触毒性。
4.AS-Ⅳ促进海马神经元PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降
RT-qPCR、Westernblotting和免疫组化检测结果显示Aβ1-42注射组小鼠海马BDNF和PPARγmRNA和蛋白水平均显著下降；AS-Ⅳ能显著增加Aβ1-42注射的小鼠海马PPARγ和BDNFmRNA和蛋白表达，同时上调TrkB蛋白的磷酸化水平。此外，PPARγ和BDNF免疫荧光共标观察结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马PPARγ表达下降的同时伴有BDNF的表达也明显下降；AS-Ⅳ能明显增加Aβ1-42注射的小鼠海马区PPARγ表达的同时伴有BDNF表达的增加。此外，在Aβ1-42注射的小鼠中，PPARγ抑制剂GW9662和AS-Ⅳ联合给药不但阻断了AS-Ⅳ对PPARγ表达的影响，同时也阻断了AS-Ⅳ对BDNF表达的影响。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进海马神经元PPARγ表达，继而抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降并激活BDNF/TrkB信号通路。
5.AS-Ⅳ促进海马神经元PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的神经炎症
ELISA检测结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著升高；AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42诱导的小鼠海马IL-1β、IL-6和TNF-α的含量增加；PPARγ和GFAP免疫荧光共标及Westernblotting检测结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马PPARγ表达显著减少的同时伴有GFAP表达的显著增加；AS-Ⅳ上调Aβ1-42诱导的小鼠海马PPARγ表达的同时伴有GFAP表达显著下降；PPARγ抑制剂GW9662与AS-Ⅳ联合用药则能阻断AS-Ⅳ对Aβ1-42诱导的小鼠海马IL-1β、IL-6、TNF-α、PPARγ和GFAP表达的影响。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进海马PPARγ表达，继而抑制海马区胶质细胞的增生，降低促炎因子的表达，减轻Aβ1-42诱导的神经炎症。
6.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的海马神经元凋亡
TUNEL染色、透射电镜和Westernblotting检测结果显示Aβ1-42注射的小鼠海马区神经元凋亡形态明显，Cleavedcaspase-3蛋白表达显著上升；AS-Ⅳ能显著下调Aβ1-42诱导的小鼠海马神经元Cleavedcaspase-3蛋白的表达，抑制神经元凋亡。
本章小结
AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，进而上调BDNF水平并激活BDNF/TrkB信号通路，修复突触损伤，抑制海马区胶质细胞的活化，降低促炎因子的表达，减轻神经炎症反应，阻止海马神经元凋亡，改善Aβ1-42诱导的小鼠认知功能障碍。
第二部分黄芪甲苷对Aβ1-42诱导的HT-22细胞的保护作用及其机制
目的
研究AS-Ⅳ对Aβ1-42诱导的HT-22细胞的影响及其机制。
方法
以10μMAβ1-42损伤HT-22细胞48h建立AD样细胞模型。采用MTT法检测细胞存活率；LDH法检测细胞损伤度；台盼蓝染料排斥实验检测细胞死亡率；RT-qPCR检测BDNF和PPARγmRNA水平；采用PPARγRNAi技术和PPARγ特异性抑制剂(GW9662)处理，Westernblotting检测BDNF、t-TrkB、p-TrkB、PPARγ和Cleavedcaspase-3蛋白的表达；ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α的含量；流式细胞术检测细胞内活性氧的水平；DAPI染色荧光显微镜和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡程度。
结果
1.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞毒性
MTT检测结果表明AS-Ⅳ在5-100μM浓度范围内能显著增加Aβ1-42诱导的细胞存活率，且呈量效依赖性。当AS-Ⅳ浓度达到500μM时，与Aβ1-42处理组比较，细胞存活率差异不显著。LDH法检测结果表明Aβ1-42处理后细胞损伤程度显著增加；AS-Ⅳ(25、50、100μM)预处理后细胞损伤程度显著减轻；台盼蓝染色后镜下可见Aβ1-42处理组细胞死亡率显著增加，AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42诱导的细胞损伤和死亡。
2.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞BDNF水平下降
RT-qPCR及Westernblotting检测结果显示HT-22细胞经10μMAβ1-42作用后，BDNFmRNA和蛋白表达及TrkB的磷酸化水平均显著降低；与外源性BDNF作用效应一致，AS-Ⅳ能显著上调Aβ1-42诱导的BDNFmRNA和蛋白表达及TrkB的磷酸化水平，且呈浓度依赖性；此外，单用AS-Ⅳ也能显著促进正常HT-22细胞(未加Aβ1-42处理)中BDNF蛋白的表达。上述结果表明AS-Ⅳ能抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降并激活BDNF/TrkB信号通路。
3.AS-Ⅳ促进HT-22细胞PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降
Westernblotting检测结果发现在正常HT-22细胞中干扰PPARγ，阻断其表达后，BDNF蛋白水平亦显著下降；在Aβ1-42诱导的HT-22细胞中，干扰PPARγ或使用PPARγ抑制剂GW9662阻断其表达后均能显著逆转AS-Ⅳ对BDNF蛋白表达的影响；此外，HT-22细胞经Aβ1-42损伤后PPARγmRNA和蛋白水平均显著下降；AS-Ⅳ能显著上调Aβ1-42诱导的PPARγmRNA和蛋白水平；同时，单用AS-Ⅳ也能促进正常HT-22细胞(未加Aβ1-42处理)中PPARγ蛋白的表达。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，进而抑制Aβ1-42诱导的BDNF水平下降。
4.AS-Ⅳ促进HT-22细胞PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的炎症反应
ELISA检测结果显示HT-22细胞经10μMAβ1-42作用后，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著升高；AS-Ⅳ能显著降低Aβ1-42诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，呈浓度依赖性；PPARγ抑制剂GW9662能显著逆转AS-Ⅳ这一效应。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，继而降低促炎因子表达，抑制Aβ1-42诱导的炎症反应。
5.AS-Ⅳ抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞氧化性损伤和凋亡
流式细胞仪检测结果显示Aβ1-42诱导了HT-22细胞内活性氧水平的显著升高；与NAC作用效应一致，AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42所致的HT-22细胞氧化性损伤；
此外，与AS-Ⅳ作用效应一致，外源性BDNF也能显著减轻Aβ1-42诱导的神经毒性；而PPARγ抑制剂GW9662显著逆转AS-Ⅳ对Aβ1-42诱导的HT-22细胞存活率的促进作用。DAPI染色、AnnexinV-FITC/PI双染和Westernblotting检测结果进一步表明Aβ1-42诱导了HT-22细胞的凋亡；与外源性BDNF作用效应一致，AS-Ⅳ能显著下调Aβ1-42诱导的Cleavedcaspase-3蛋白的表达，抑制细胞凋亡；而PPARγ抑制剂GW9662显著逆转AS-Ⅳ的抗凋亡效应。上述结果表明AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，抑制Aβ1-42诱导的细胞凋亡。
本章小结
AS-Ⅳ能显著抑制Aβ1-42诱导的HT-22细胞损伤、炎症反应和凋亡，该作用可能与其促进PPARγ表达，进而上调BDNF水平并激活BDNF/TrkB信号通路有关。
结论
在Aβ1-42处理的小鼠海马神经细胞HT-22和C57BL/6小鼠中，AS-Ⅳ通过促进PPARγ表达，进而上调BDNF水平并激活BDNF/TrkB信号通路，修复突触损伤，减轻神经炎症，抑制海马神经元损伤和凋亡，从而改善认知功能障碍，发挥神经保护作用。