论文部分内容阅读
创伤后皮肤缺损是临床最常见的病症之一,仅靠创面自身难以实现皮肤的再生,需要足够的皮肤替代物进行修复。开发具有生物活性的人工皮肤替代物,已成为治疗创伤后皮肤缺损的重要策略。组织工程成功与否取决于以下三个关键性制约因素:种子细胞,支架材料以及有助于细胞生长、分化的外在环境。其中种子细胞一直是组织工程研究的核心问题,理想的种子细胞应该具有容易获得、容易在体外培养增殖、长期传代不改变生物学特性、抗原性小、组织修复能力强等特征。近年来干细胞的研究发现骨髓间充质干细胞(MSCs)具备作为组织工程种子细胞的条件,并在组织工程骨的研制中被广泛应用。但目前关于MSCs在皮肤缺损愈合中的作用鲜见报道。MSCs能否作为种子细胞应用于组织工程皮肤的构建?以其构建的组织工程皮肤能否促进皮肤缺损愈合?基于这一思路,本研究利用细胞培养技术、基因工程技术及组织工程技术,从构建组织工程皮肤的种子细胞入手,分离纯化了MSCs,实现了其体外长期传代及大量扩增,并对MSCs进行了EGF基因修饰。在此基础上,构建组织工程皮肤生物支架,进而将MSCs种植于生物支架材料上,与角质形成细胞复合构建组织工程皮肤。体内实验结果表明,用MSCs作为种子细胞所构建组织工程皮肤对皮肤缺损具有显著促愈作用,而MSCs经EGF修饰后促愈作用更为明显。本实验主要结果及结论如下:1. 在综合帖壁法和密度梯度离心法分离MSCs的基础上,利用双层过滤法对MSCs进行纯化,优化了MSCs分离纯化方法。所得MSCs形态均一,细胞核原始,细胞器不发达;传至25代未见老化现象;体外增殖迅速;具有MSCs表面标志物;保持了向成骨及成脂分化的潜能,诱导分化后期成骨及成脂分化能力强于传统密度梯度离心法所获细胞。2. 制备的生物支架材料符合组织工程皮肤胶原多孔膜的最优结构。3. 利用基因工程技术成功构建pcDNA3.1/EGF真核表达载体,完成对MSCs的基因修饰;在体外培养条件下实现EGF的稳定高效释放,达ng级,可促进MSCs增殖;对MSCs的生长及分化没有影响。4. 利用组织工程技术成功构建组织工程皮肤,可以适应手术需求;对受体免疫功<WP=12>能没有影响;生物相容好;生物安全性好;生物力学指标符合要求。5. 利用MSCs作为种子细胞所构建组织工程皮肤对皮肤缺损具有显著促愈作用,创面经修复后具有全层皮肤结构。6. 利用EGF基因修饰后的MSCs作为种子细胞所构建组织工程皮肤促愈作用更为明显。