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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是危害水禽养殖业最重要的病原性细菌之一,血清型众多、各血清型间缺乏交叉免疫保护,极易产生耐药性,由于疫苗及药物在疾病防治中存在局限性,使其已成为严重危害养鸭业的主要病原之一。研究该细菌的致病机制,是研发新型疫苗与药物的基础,也是防治该病必须解决的关键科学问题。补体系统作为先天免疫系统的重要组成部分,是由近40种蛋白组成的限制性蛋白水解系统,该系统由经典途径（classical pathway,CP）、凝集素途径（lectin pathway,LP）和旁路替代途径（alternate pathway,AP）三条途径激活,激活后将继续进行对主要补体分子C3、C5的裂解以及膜攻击复合物（membrane attack complex,MAC）的组装,最终裂解靶细胞。C4BP（c4b-binding protein,C4BP）作为补体系统中液相调节因子之一,可与C2分子竞争性结合C4b,抑制C3转化酶的形成,同时作为I因子的辅助因子,促进对C4b的裂解,短缩CP和LP中C3转化酶的半衰期,阻断补体系统的激活。已有研究表明,部分病原性细菌可凭借自身外膜蛋白招募C4BP至其表面,阻断补体系统的激活介导免疫逃避。病原性细菌感染宿主需要逃逸补体系统的清除,而不同细菌逃逸的机制存在差异,因此逃避补体系统清除机制是病原性细菌的毒力因子及致病机制研究的重要内容。但目前有关RA介导补体免疫逃避机制的研究还是一片空白。本研究在实验室前期基础之上,通过生物学信息分析对鸭C4BPα的补体调控结构域SCRs（short conensus repeats,SCRs）进行原核表达,并以此作为诱饵蛋白,联合His-pull down与LC-MS/MS蛋白质谱技术,筛选出与鸭C4BP发生互作的RA免疫逃避靶蛋白,明确其相互作用区域并初步探究靶蛋白生物学功能。通过上述研究,期望为进一步研究RA致病机制及新型疫苗靶点的探索提供理论基础。本研究取得以下成果。1.鸭C4BPα基因原核表达及多克隆抗体制备根据鸭C4BPα序列设计SCRs1-6特异性引物,经T-A克隆获得重组克隆载体,目的片段大小为1080bp。以质粒p Cold-TF构建鸭C4BPα原核表达载体,以E.coli BL21（DE3）为表达宿主菌,IPTG诱导,超声破碎后经SDS-PAGE检测,获得蛋白大小约为91.6KDa的可溶性蛋白。将破碎后上清进行非变性SDS-PAGE,考马斯亮蓝R-250染色后,切取目的蛋白凝胶条带,经处理后制备免疫抗原。BALB/c小白鼠经三次免疫,待三免后15天采集血液并分离血清。经Western-bolt发现,制备的鼠抗鸭C4BPα能与重组蛋白鸭C4BPα发生特异性反应。间接ELISA测定血清效价,当鼠抗鸭C4BPα稀释至1:12800时,P/N值为5.239。2.结合鸭C4BPα的免疫逃避蛋白鉴定经斑点杂交试验发现,血清型为1型、2型、4型、14型的RA菌株均能招募健康鸭血清中的C4BP。在此基础上,以纯化的鸭C4BPα重组蛋白作为诱饵蛋白进行His-pull down及LC-MS/MS蛋白质谱鉴定。根据鉴定结果中各蛋白肽段覆盖率、鉴定得分及相关功能进行综合分析,最终筛选出三个与鸭C4BPα可能发生互作的候选外膜蛋白,即ECE-1、SODs、O mp62。经Far-Western blot验证,仅ECE-1能够与鸭C4BPα发生互作。3.免疫逃避蛋白与鸭C4BPα的结合区域鉴定为探究ECE-1与鸭C4BPα的结合区域,针对ECE-1功能结构域:N端、C端及部分截短片段设计引物进行原核表达载体构建。在对各片段蛋白进行Ni2+亲和纯化、凝血酶切除His-tag的基础上,进行Far-western blot,试验结果表明:仅ECE-1全长能与鸭C4BPα互作。同理,为探究鸭C4BPα与ECE-1的结合区域,针对鸭C4BPα各SCRs进行原核表达载体构建,以各SCRs重组蛋白为探针进行Far-western blot,结果表明:鸭C4BPα与ECE-1的结合区域位于鸭C4BPα链的SCRs 2、SCRs 3。4.补体因子沉积测定以RA-AF株为研究对象,将ECE-1抗体预先与RA孵育后,再与健康鸭血清孵育,利用洗脱液将RA表面沉积蛋白洗脱,通过间接ELISA分别检测洗脱液中C3b、C4b及C4BP含量。结果显示,当健康鸭血清浓度为3.125%时,EC E-1抗体能够显著促进补体因子C3b、C4b于RA表面的沉积作用（p<0.05）;当健康鸭血清浓度为6.25%时,ECE-1抗体能够显著抑制C4BP于RA表面的沉积作用（p<0.05）。5.血清杀菌活性及免疫吞噬调理测定以RA-AF株为研究对象,在抗体介导的血清杀菌试验中,ECE-1抗体预先与RA孵育后再与健康鸭血清共孵育,利用活菌计数计算相对存活率,结果显示ECE-1抗体可极显著促进补体的直接杀伤作用（p<0.01）,此外促进作用与抗体浓度具有剂量依赖性,最高有效稀释度为1:64（p<0.01）;在免疫吞噬调理试验中,ECE-1抗体预先与RA孵育后再与巨噬细胞共孵育,利用活菌计数计算相对存活率,结果显示ECE-1抗体可极显著促进巨噬细胞的吞噬调理作用,且促进作用与抗体浓度具有剂量依赖性,最高有效稀释度为1:16（p<0.05）。综上所述,本研究成功筛选到1个与鸭C4BP结合的RA免疫逃避蛋白,即ECE-1。ECE-1与C4BP结合区域为C4BPα链的SC R2、SCR3;ECE-1结合C4BP后,能抑制C3b、C4b于RA表面沉积;ECE-1抗体能够介导血清杀伤活性及免疫吞噬调理作用。