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利用脉冲电泳从链霉菌HK菌株中检测到一个大的线型质粒pSHK1,克隆和测序包括两个新的端粒序列,获得了全长为187,263 bp的序列。pSHK1序列的G+C含量为70.1%,预测编码158个开放阅读框(orf:open reading frame),其中90个与已知蛋白编码基因同源(占总数的57%),41个与预测存在的蛋白同源,而可能存在的未知蛋白是27个。与已知基因同源的包括与基本复制相关的基因(pSHK1.13c,pSHK1.14c)、与接合转移相关的基因(pSHK1.93-pSHK1.96)、与复制分配相关的基因(pSHK1.118c,pSHK1.119c)及菌株之间转移的基因(pSHK1.97),然而未发现与端粒复制相关的基因。还发现了20个与转座酶同源性很高的编码框,其中有14个成对存在。另外还发现了在原核生物中普遍存在的特殊重复序列——CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)。这是首次在链霉菌的线型质粒发现此类DNA序列,共200个拷贝重复,总长度达到12 kb之多,分别成簇存在于pSHK1的中部7个位点(CRISPR1-CRISPR7)。
比对分析发现位于线性pSHK1全长的三分之一处有一段区域与已报道的天蓝色链霉菌线型质粒SCP1的复制区相似。PCR扩增该pSHK1片段后克隆至复制子探针载体,转入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)ZX7,证明了其自主复制的功能。进一步鉴定了最小的复制区大小为3.6 kb(G+C含量为66.26%),包括了2个基因pSHK1.13c和pSHK1.14c、以及重复序列(iteron)。
通过GenBank数据库比对分析,在已测序的放线菌不同属的基因组中也发现了与链霉菌线型质粒pSHK1上类似的CRISPR-cas基因簇,暗示其作为整体单元在不同放线菌中进行水平转移的可能性。利用较保守的cas4基因的序列设计引物、PCR扩增和测序,发现67株不同的链霉菌中有9株存在cas4基因,显示其较广泛的分布。通过RT-PCR,检测到8个连续排列的cas基因共同转录在一个操纵子中。酵母双杂交实验结果表明,Cas5蛋白与Cas1A、2A、2B和Cas3B蛋白有相互作用,暗示Cas5在形成蛋白复合体中可能起关键作用。
前人在其它细菌中发现CRISPR具有限制外源的噬菌体侵染和质粒DNA转化的生物学功能。为验证线型质粒pSHK1上的CRISPR-cas是否具有类似的功能,检验pSHK1上其它独立的CRISPR、先导序列等是否在此过程了发挥作用,以及进一步探索这种限制的中间体,我们构建了一系列载体。利用转化原生质体及接合转移等遗传操作手段,试图证实CRISPR赋予链霉菌对噬菌体和质粒的抗性。初步的实验结果表明pSHK1上的CRISPR-cas对于外源质粒的转化(双链DNA)和接合转移(单链DNA)导入均有限制性。