论文部分内容阅读
拟南芥叶绿体中存在RNA编辑的现象。目前认为RNA编辑主要由PPR蛋白以及其他非PPR蛋白共同参与。MORF家族蛋白是一类非PPR蛋白,能影响几乎所有位点的编辑,且与很多PPR蛋白互作。因此,人们推测在RNA的编辑过程中存在一个“编辑体”,其中MORF蛋白作为编辑体的核心,但是对于编辑体的了解目前还十分有限。本论文中,我们直接针对叶绿体定位的三个MORF蛋白(MORF2,MORF8和MORF9)进行了一系列的研究,从整体的角度对编辑体有了一个较为全面的认识。首先,我们构建了MORF2、MORF8和MORF9融合MYC标签的转基因植株。我们通过分离转基因植株的叶绿体基质和类囊体,对这三个MORF蛋白进行了精细定位分析,Western结果显示MORF2主要定位在叶绿体基质中,少量定位于类囊体膜上;而MORF8和MORF9主要定位在类囊体膜上。通过Blue Native实验,我们首次明确了叶绿体定位的MORF蛋白在体内形成复合物的大小。MORF2和MORF9都主要存在于一个67kDa~140kDa的复合物中,而MORF8分布的比较广,存在于大于232kDa的复合物中。其次,我们利用蛋白质免疫共沉淀并结合质谱实验研究了MORF蛋白所在复合物的具体组分。对MORF2,MORF8,MORF9的质谱结果运用MapMan软件进行了分析,选取一些RNA加工相关蛋白,通过酵母双杂验证这些蛋白与MORF2,MORF8以及MORF9之间的相互作用。结果显示这些蛋白与MORF蛋白之间并不存在直接互作。MORF2和MORF9蛋白在体内形成复合物的大小一致,且我们发现MORF9能够免疫共沉淀MORF2;同时MORF2和MORF9都能够参与ndhD位点的编辑,因此MORF2和MORF9在RNA编辑中联系紧密,其可能构成一个编辑体的核心。通过RNA-EMSA实验我们发现在编辑过程中MORF2和MORF9并不能直接结合RNA,所以MORF2和MORF9可能只是在编辑过程中起到稳定编辑体的作用。