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[目的]三阳血傣(SYKT)是云南民间傣药的传统方剂,选自《贝叶经》,由生姜、血竭、甘草、茯苓、砂仁、三七、当归等8味中药精制而成。前期研究显示SYKT具有刺激骨髓造血、保护蒽环类化疗药物所致的心肌损伤等作用。临床实践发现联合应用三阳血傣的肺癌病人在放疗中能够获得生存及生活质量的获益,但其作用机制目前尚无深入研究,本研究将从动物、细胞及分子水平3个层次探讨三阳血傣的放射增敏及防护作用,并对其分子作用机制进行初步的探讨。[方法]首先从回顾性临床研究分析SYKT的有效性,收集符合条件的289例ⅢA/ⅢB期非小细胞肺癌(NSCLC)患者,通过放疗期间是否规律使用SYKT分为两组,评价放疗疗效并且进行生存分析;然后通过体外实验考察SYKT是否具有放射增敏作用,用MTT法检测4株NSCLC细胞在SYKT处理后的细胞增殖筛选细胞。以筛选出的NCI-H460为基础建立放射抗拒细胞NCI-H460R,不同浓度SYKT处理NCI-H460和NCI-H460R细胞并照射,分别用克隆形成实验、MTT和BrdU染色、Griess法、流式细胞术检测两株细胞的增殖、周期和凋亡等评价SYKT的放射增敏作用;接着进行小鼠皮下成瘤实验考察SYKT对正常组织的放射防护作用,将C57BL/6小鼠分别给予空白、放射、SYKT给药及SYKT给药联合放疗处理进行照射,绘制生存曲线,通过检测外周血细胞计数,骨髓、脾脏、胸腺的凋亡率、脾指数、胸腺指数等评估免疫器官损伤程度,用酶联免疫法(ELISA)来检测细胞内活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)水平,评估SYKT的放射防护作用;最后选用脾脏、胸腺的间质细胞MTSCc、C57/B6-SPL 在细胞层面通过 Western-Blot 和 Real time-PCR 检测细胞中 p53、p38、JNK的活化、胞浆及线粒体蛋白、胞浆及线粒体中Bax及细胞色素C的表达、细胞凋亡相关蛋白caspase-3及ADP核酸聚合酶(Poly ADPRibose Polymerse,PARP)的表达、DNA损伤修复相关蛋白Ku70、Ku80、DNA-PKcs的mRNA和蛋白表达来探讨SYKT放射防护作用的分子机制。[结果]1.中位随访时间31个月(2-67月),观察组1年,2年,3年,5年生存率分别是84.79%、64.41%、30.35%、18.37%,对照组1年,2年,3年,5年生存率分别是 80.38%、58.86%、27.85%、14.46%;中位 OS分别是 27.3 月(1-65 月)和23.1月(1-59月),观察组显著长于对照组(P=0.01);观察组中位PFS 10.8月(1-29.8月),对照组中位PFS 9.6月(1-25.6月),组间差异无统计学意义(P=0.491)。靶病灶有效率观察组 74.81%(98/131),对照组 56.96%(90/158)(P=0.002),组间差异有统计学意义;Ⅲ。及以上骨髓抑制在观察组和对照组分别为21例(16.03%)、43例(27.22%),差异有统计学意义(P=0.023);观察组KPS评分及体重改善方面优于对照组,且在体重改善中组间差别有统计学意义(P<0.05)。治疗结束后1月两组均出现明显免疫功能降低,其中对照组下降较观察组明显,组间差异有统计学意义(P=0.001)。2.SYKT在NCI-H460细胞中的IC10值为1.03g/ml。经过1g/ml SYKT处理后的NCI-H460R细胞放射敏感性有所增强。照射后细胞中iNOS含量下降。SYKT能提高抗辐射细胞中iNOS和NO的表达,抑制周期蛋白B1和CDC2的表达水平;细胞周期和细胞凋亡检测结果显示:SYKT处理联合β射线照射后细胞出现G2/M期阻滞,凋亡水平增加。3.通过对各组小鼠的检测,放射组生存率最低,SYKT给药联合放射组生存率较放射组有所改善(P=0.031),放射组外周血细胞及骨髓CD34+及CD44+细胞计数减少较SYKT联合放射组明显(P=0.022),放射组骨髓细胞凋亡率升高较联合组明显(P=0.035),放射组脾指数及胸腺指数均较联合组低(P=0.023、P=0.037),放射组脾细胞及胸腺细胞凋亡率均较联合组低(P=0.039、P=0.041),差异均有统计学意义;此外,放射组小鼠骨髓细胞、脾脏、胸腺细胞中ROS的水平均明显升高,且与细胞凋亡率成正比;而联合SYKT后细胞ROS生成减少,细胞凋亡率降低。另外,小鼠皮下成瘤体积大小及肿瘤细胞凋亡率在放射及放射联合三阳血傣组未见明显差异。4.在小鼠MTSCc、C57/B6-SPL细胞中,放射处理后引起前凋亡蛋白p53、p38、JNK活化,Bax转位,参与caspase依赖的凋亡信号途径,并引起MTSCc、C57/B6-SPL细胞凋亡。而联合SYKT后,活化的p53、p38、JNK表达减少,Bax转位减弱,细胞色素C释放减少,凋亡相关蛋白caspase-3及PARP表达降低,MTSCc、C57/B6-SPL细胞凋亡明显受到抑制。SYKT可通过抑制p53及MAPKs活化阻止细胞凋亡途径,起到防护效应。同时,放射处理后联合SYKT组DNA损伤修复蛋白Ku70、Ku80、DNA-PK mRNA的表达均较单纯放疗组升高。[结论]1.放疗联合SYKT能够在提高局部病灶有效率的情况下改善预后,同时能够改善放化疗所致的体重及一般状况的下降,此外可以改善骨髓抑制及免疫功能的下降。2.SYKT可能通过放疗后促进iNOS的表达来促进NO的表达,并可通过在G2/M期细胞阻滞来调节细胞凋亡和细胞周期来实现放疗增敏的作用。3.SYKT可以缓解放射诱导的小鼠骨髓抑制及免疫器官毒性,且并不影响射线的抗肿瘤疗效。作用机制可能是通过抑制细胞中ROS的生成从而减少骨髓及免疫器官细胞的凋亡。联合SYKT可能成为减轻放疗患者骨髓抑制及免疫损伤的一种新的,安全有效的辅助治疗方法。4.射线通过活化p53及JNK-p38介导的细胞凋亡信号通路诱导MTSCc、C57/B6-SPL细胞凋亡。SYKT可以有效的抑制这一过程从而起到放疗防护的作用。