论文部分内容阅读
芥酸含量是影响菜籽油品质的重要因素之一。利用常规遗传育种技术已经育成了低芥酸油菜,菜籽油品质得到了进一步的提高。但是由于仍然有高芥酸油菜的种植,菜籽油的品质得不到保证。本研究试图利用RNAi技术抑制芥酸合成相关基因的表达,培育显性低芥酸油菜品系,从而确保菜籽油的优良品质,并同时拓宽杂交亲本谱,进一步提高油菜产量。本文针对低芥酸形成的分子机理,重点研究“中双6号”C基因组的FAE1基因第1422-1423位点2个碱基的缺失对芥酸合成的影响。在此基础上,通过基因工程方法研究芥酸合成相关基因对油菜种子芥酸合成的影响,培育子转基因低芥酸油菜品系。获得的主要结果如下：1、油菜低芥酸突变体研究：对第一个低芥酸油菜品种Oro、中国30个低芥酸栽培种及高芥酸油菜‘中油821’的FAE1基因进行克隆后测序,分析了栽培种FAEl的突变类型。外源基因的酵母表达分析显示,eC2不能表达完整的蛋白酶,不能缩合形成C22：0和C22：1。在低芥酸油菜中,ECR和KCR都在种子发育过程中协同表达,与突变后的FAE1不协同表达。2、干扰芥酸合成相关基因对油菜芥酸合成的影响：以芥酸合成途径中的FAE1、 ECR、KCR和HCD作为靶标基因,分别构建了反义抑制载体和ihpRNA干扰载体,转化高芥酸甘蓝型油菜“中油821”。反义和ihpRNA抑制载体获得转基因株系共计109株。反义抑制FAE1的转丛因株系T2代种子平均芥酸含量为34.36%,反义抑制HCD的转丛因株系平均芥酸含量为34.33%,与对照相比分别下降8.6%、8.63%(p<0.01)；最低芥酸含量的株系是aFAE1189B134,为13.33%。ihpRNA转基因株系中,干扰FAEl的转基因株系平均芥酸含量降至34.29%(p<0.01),单株芥酸含量最低降至24.56%(iFAE1229B75)。iKCR株系平均芥酸含量降至32.03%,最低降至16.09%。iHCD株系平均芥酸含量为33.76%(p<0.01),单株中芥酸含量最低的是iHCD368,芥酸含量为8.53%。干扰超长链复合体中FAE1、KCR、ECR和HCD后均影响油菜种子中芥酸的合成,说明这4个基因在芥酸合成过程中起着不可或缺的作用,都可作为选育转基因低芥酸品种的靶标基因。3、转丛因低芥酸油菜的选育：转p121NapDsfaelD500(i500-821株系)、p121NapDsfael D800和pl21NapDsfael D1500的转基因株系的平均芥酸含量分别降至28.03%(p<0.01)、18.23%(p<0.01)和31.0%(p<0.05)。通过Southern杂交分析确定了部分转基因株系的拷贝数。部分转基因株系中靶标基因FAE1的表达量发生了下降,降幅在60%以上;其中i800-821059A17株系的表达量下调最大,表达量下降了97%,同时,KCR和ECR表达量与对照相比显著下调(p<0.01)。利用Western杂交分析了各转基因株系40DAF种子中FAE1蛋白的表达,转基因株系i800-821023A16、i800-821059A17、i800-821068A18蛋白有微弱表达。转基因株系i800-821068A18的T2代种子中芥酸含量为1.58%,T3代种子中芥酸含量为3.11%,低芥酸性状能稳定遗传。T2代种子中含油量为35.18%,与对照相比下降6.43%;其硫甙含量为108.06μmol/g左右,蛋白含量在24%左右,与对照相比提高了4.05%。转基因株系i800-821068A18种子中,芥酸合成通路相关基因表达量下调,脂肪酸合成相关基因的表达受到不同程度的扰动。与高芥酸品种正反交杂种后代种子中芥酸含量为5.47%和2.95%,达到低芥酸标准。