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目的:(1)检测四株人结肠癌细胞株中p16基因甲基化状态。(2)观察p16基因甲基化的结肠癌细胞株Caco-2在去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后对其生长抑制现象、对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性以及5-FU诱导的细胞凋亡敏感性方面的变化,为结肠癌的发生机制和联合治疗提供理论依据。方法:采用MSP法检测四株不同的人结肠癌细胞株中p16基因启动子区甲基化状态,应用不同浓度(0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L以及5μmol/L)的5-Aza-CdR处理人结肠癌细胞株Caco-2,观察处理前后p16基因mRNA表达水平的变化情况;采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测5-Aza-CdR及5-FU对细胞株Caco-2的生长抑制作用、RT-PCR及western-blotting检测凋亡相关基因bax、bnip3、bcl-2的表达变化、流式细胞仪检测细胞凋亡情况的变化以及Giemsa染色普通光学显微镜及Hoechst 33342染色荧光显微镜观察去甲基化处理前后的细胞株在细胞形态学方面的改变。结果:(1)采用MSP方法检测四株结肠癌细胞株中p16基因的甲基化状态,p16基因在Caco-2及RKO细胞株中启动子区呈完全甲基化状态;在SW480及HCT116中呈半甲基化状态。(2)采用四种不同浓度5-Aza-CdR(0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L以及5μmol/L)处理人结肠癌细胞株Caco-2 72h后,可检测出p16 mRNA表达。MSP结果显示,经1.25μmol/L、2.5μmol/L及5μmol/L 5-Aza-CdR处理后同时检测出甲基化及非甲基化引物扩增的产物。(3)5-Aza-CdR及5-FU处理后的Caco-2细胞株生长速度均明显慢于正常组(P＜0.01)。(4)5-Aza-CdR对5-FU诱导的Caco-2细胞的早期凋亡随着时间延长而增加;5-Aza-CdR联合5-FU诱导Caco-2细胞凋亡的作用优于两者单纯相加,具有协同作用(P＜0.05)。(5)5-Aza-CdR联合5-FU处理组中Caco-2细胞株可观察到细胞凋亡所特有的典型形态学特征。(6)RT-PCR及western-blotting均显示联用药组凋亡相关基因bax及bnip3表达显著增强(P＜0.01),bcl-2的表达明显减弱(P＜0.01)。结论:(1)p16在人结肠癌细胞株Caco-2中表达沉默,DNA甲基化是其表达沉默的机制之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR可以逆转并恢复基因的重新表达。(2)5-Aza-CdR及5-FU对Caco-2细胞株生长速度均有较明显的抑制作用。(3)5-Aza-CdR联合5-FU诱导Caco-2细胞凋亡的作用优于两者单纯相加,具有协同作用。其中联合用药组可观察到细胞凋亡所特有的典型形态学特征。(4)5-FU诱导细胞凋亡具有时效性;5-Aza-CdR能通过上调促凋亡基因bnip3和bax以及下调抑凋亡基因bcl-2基因表达以增强5-FU诱导Caco-2细胞凋亡的能力。