论文部分内容阅读
背景和目的TGFβ1诱导的肾小管上皮间质转化(EMT)在糖尿病肾脏病(DKD)肾纤维化中起关键作用,HMGA2被报道通过多重机制参与TGFβ 1诱导的EMT的发生过程。微小RNA(miRNA)作为重要的转录后水平调控因子也参与EMT的发生。既往对TGF β 1/HMGA2在EMT中的研究多集中于肿瘤或其他器官领域,而在DKD背景下,尤其是在肾小管上皮细胞EMT及纤维化进程中的作用目前并不明确。本研究拟探讨HMGA2对TGFβ 1诱导的肾小管上皮细胞EMT及纤维化过程的影响和作用,并进一步针对靶基因HMGA2,研究其上游miRNA对HMGA2的影响及参与DKD肾纤维化的潜在作用机制。通过上述研究,将有助于我们据此针对有效的信号通路发现重要的干预和治疗靶点,从而为DKD肾纤维化的治疗提供新的思路。方法1.建立TGFβ 1刺激大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)的细胞模型,利用qRT-PCR及western blot的方法检测TGFβ 1刺激前后HMGA2及EMT相关基因的表达变化。2.利用siRNA转染的方法验证HMGA2在TGF β 1诱导的EMT及肾纤维化中的作用,用qRT-PCR及western blot检测siRNA沉默HMGA2基因前后其下游转录因子的表达变化。3.通过生物信息学方法,针对靶基因HMGA2筛选有价值的上游mmiRNA,用qRT-PCR检测TGF β 1诱导NRK-52E细胞前后各miRNA的表达差异,同时进一步于UUO小鼠模型中探索HMGA2及其上游miRNA的表达变化。4.通过过表达(转染miRNA mimics)和抑制(转染miRNA inhibitors)的功能实验进一步验证筛选出的miRNA对TGFβ1诱导的EMT和肾纤维化的影响和作用。用qRT-PCR及western blot检测HMGA2及EMT相关因子于miRNA过表达及抑制前后的表达情况。结果1.qRT-PCR 及 western blot 结果表明:给予 10ng/mL TGFβ1 刺激 NRK-52E细胞 48h 后,与 Control 组比较,TGFβ 1(48h)组中 HMGA2、α-SMA、vimentin、Col-I及FN的表达均明显升高,E-Cad的表达明显降低。2.qRT-PCR及western blot结果表明:转染siRNA-HMGA2能明显抑制TGFβ1诱导的NRK-52E细胞中HMGA2及α-SMA、vimentin表达的上调以及E-Cad表达的下调;转染siRNA-HMGA2对其下游转录因子Snail,Slug和Twist的表达无明显影响。3.针对靶基因HMGA2,筛选出有价值的上游miRNA:miRNA-let-7d、miRNA-98、miRNA-33;qRT-PCR 结果显示:miRNA-let-7d 在 TGFβ1诱导的 NRK-52E 细胞及UUO小鼠肾脏中的表达均明显降低,而HMGA2的表达则呈反向升高;TGFβ1的刺激对miRNA-98及miRNA-33的表达无明显影响。4.qRT-PCR及western blot结果表明:转染let-7d mimic能明显抑制TGFβ1诱导的NRK-52E细胞中HMGA2及α-SMA、Col-I、FN表达的上调以及E-Cad表达的下调;转染let-7d inhibitor能明显增强TGFβ 1诱导的HMGA2及Col-I、FN表达的上调以及E-Cad表达的下调。结论1.TGFβ 1可诱导NRK-52E细胞中HMGA2的高表达,并使细胞发生EMT及纤维化改变。2.对HMGA2进行基因沉默(siRNA-HMGA2)可逆转TGFβ1诱导的EMT及纤维化改变,它是一个重要的靶基因。3.miRNA-let-7d 为 HMGA2 重要的上游 miRNA,miRNA-let-7d/HMGA2 在 TGFβ 1诱导的EMT及肾纤维化进程中可能发挥作用。4.过表达miRNA-let-7d可下调HMGA2的表达,进而抑制TGF β 1诱导的EMT及肾纤维化改变;抑制miRNA-let-7d可上调HMGA2的表达,进而加快TGFβ1诱导的EMT及肾纤维化进展。5.miRNA-let-7d可能通过调节HMGA2的表达从而调控肾小管上皮细胞转分化及纤维化,干预这一过程可能是一个预防和治疗DKD肾纤维化的新途径。