研究背景:肝脏是人体最大、最重要的腺器官,几乎参与着体内的一切新陈代谢活动。另外,其特有的解毒和吞噬免疫功能使其成为人体最重要的屏障器官。近二十年来,肝脏疾病对人类健康的危害日益加深,每年有逾数万例患者会患上该病,终末期肝衰竭患者通常伴随着严重的代谢紊乱,神经系统并发症,最终导致多器官功能衰竭。我国是世界上病毒性肝炎和肝癌的高发国家,全球每年死于肝癌的病人多达百万于人,我国约占去了一半。至今为止,原位移植仍然是目前治疗终末期肝脏衰竭的主要治疗方法。然而,移植供肝的需求量远远地超过了目前可用的供体肝脏的数量。在此背景下,一些新方法如利用组织工程和再生医学等来实现组织、器官的功能替代成为缓解移植肝脏供需矛盾的新选择。尽管已有实验室报道证实在组织和器官结构的体外重建研究上取得了一些进展,但是由于以往体外构建的组织器官无法具备完整的血管网络,因而无法进行完善的营养及气体交换,更无法实现器官的移植。近些年,随着组织去细胞技术的发展,特别是全器官脱细胞支架的出现为制备新型组织、器官提供了可能。这些支架保留了组织中天然的细胞外基质(ECM)成分,保留了组织器官中的微架构,特别是保留了完整的血管系统,从而为实现组织器官的物质交换、与受体循环系统的吻合提供可能。目前,利用去细胞技术开发的人工器官研究已经涉及到心脏,肝脏,肺,肾等多种器官,部分实验结果令人鼓舞。然而,由于多数质厚的实质器官组结构复杂,全器官特别是大动物肝脏的脱细胞过程十分复杂。猪肝与人体肝脏大小、体型相当,易于获取,从临床意义上讲是最适合体外构建组织工程肝脏的支架材料。然而,由于猪肝组织厚实,且去细胞化灌注过程中肝内组织结构变化复杂,去细胞试剂及灌注速度的选择都将影响着去细胞化的效率。目前关于猪去细胞化肝脏的制备方法还无统一意见,分析既往文献报道我们不难发现,都需要大量的试剂、长时间的灌注来获取,既消耗实验材料,且长时间的灌注又可能将肝脏支架上有用的物质如sGAG等冲洗下来,降低支架的“活性”。因此寻找最优的大动物去细胞化方法非常必要。另一方面,肝脏结构、功能极其复杂,重建十分困难,近年来研究进展缓慢,如何进一步拓展去细胞支架的应用范围成为近些年的研究热点。众所周知,肝细胞在脱离体内生长环境后其功能迅速降低,包括细胞合成、分泌白蛋白、尿素等物质的功能降低;细胞转化、代谢药物、血氨及游离胆红素代谢所需要的依赖P450的细胞色素酶系列、谷氨酰胺合成酶(GS)、葡萄糖醛酸转移酶(UGT)及谷胱甘肽转移酶(GST)等酶类的合成、活性降低,其它如氨基转移酶ALT,AST,酪氨酸转移酶(TAT)以及乳酸脱氢酶(LDH),还有和糖类代谢相关的G-6-P等酶类也会受到不同程度的影响。因此,如何模拟肝细胞生长微环境是体外培养、扩增肝脏细胞的重点。去细胞化组织、器官支架材料保留了动物组织、器官中的大部分细胞外基质成分,其中包括器官特异性的胶原蛋白组合、糖胺聚糖(S-GAG)及各种糖蛋白等成分。因此,可以说去细胞化组织、器官支架材料是理论上最适合细胞生长的生物支架材料。近年来,去细胞化肝脏支架材料被越来越多的应用于肝脏组织工程研究过程当中。许多科学家在掌握了肝脏去细胞化技术质后都争先尝试体外利用去细胞肝脏支架进行肝脏组织重建的研究工作。近几年陆续有报道证实成功在去细胞化肝脏支架上种植、培养肝细胞、内皮细胞及干细胞等细胞材料,甚至将“再细胞化”的“组织工程肝脏”移植到体内救治肝衰动物模型。然而,由于肝脏管道空间结构极其复杂、精细,使得肝细胞、肝窦内皮细胞等在“裸露”的胶原纤维支架上更加容易受到流体剪切力等有害因素的影响,再加上这些细胞体外培养过程中容易发生“去分化”,此时,其形态、功能都表现为“退化”明显,因此有关利用去细胞化肝脏支架实施肝脏组织的重建研究进展十分缓慢。为了进一步拓展去细胞化支架的研究应用范围,我们拟通将去细胞化肝脏支架制备成一定“硬度”及形态的可溶性基质样物质。然后通过检测其中支架中各种胶原成分的比例及生物活性物质的保留程度,与I型胶原、心脏去细胞支架基质成分进行比较,观察其特异性,最后通过细胞实验证实其对肝细胞的增殖、分化等功能的特异性影响。远期通过加工、改造制备成不同三维结构的胶样产品,最后与细胞相混合培养,选择合适的微创植入方式救治肝衰动物模型。第一章猪去细胞化肝脏支架制备及成分鉴定目的:通过对猪去细胞化肝脏支架制备方案进行改进,得到优化的去细胞化支架制备流程,检验该生物支架的一般特性,为进一步利用大动物去细胞化肝脏支架进行体外研究提供可靠的材料来源。方法:以猪尸体肝脏作为研究对象,以SDS为去垢剂,针对尸肝的特点引入尿激酶、EDTA及流速等关键点进行去细胞化肝脏制备方法的优化。肝脏初步处理完成后,经肝脏门静脉插入19号硅胶管,连接蠕动泵。首先利用500mml含100000IU/L尿激酶的生理盐水进行灌洗,灌洗速度为10ml/min,然后将肝脏放入-80℃冰箱,存放时间需超过48h。继续经门静脉硅胶管灌注3000ml灌注液Ⅰ(含0.2g/L EDTA的生理盐水),灌注速度为40ml/min;灌注约15L灌注液Ⅱ (含5g/L SDS的生理盐水),灌注速度20ml/min;灌注200ml灌注液Ⅲ (含0. O1g/L DNase的生理盐水),并于4℃保存2h;灌注200ml灌注液Ⅳ (含有浓度为0. 01%的过氧乙酸),并于4℃保存3h。最后缓慢灌注含有1%青-链霉素的0.9%NaCL溶液进行冲洗,用量10L,灌注用时约8h。最后使用HE染色、PAS染色、Masson染色及电镜检查脱细胞效果,DNA分析试剂盒测定支架上DNA残余量,使用SDS-PAGE、LC-MS/MS测定支架上胶原等成分的保留状况,使用Blyscan分析试剂盒测定支架上S-GAG含量。结果:本实验灌注猪肝脏25个,成功20个,成功率80%。经门静脉注射泛影葡胺造影剂后可见去细胞肝脏支架内门静脉管道逐级显现,未见明显的造影剂渗漏情况。H-E、Masson’s染色证实支架上未见明显的细胞结构残留,可见纤维样结构完整保存,大量胶原纤维存在,并可见胶原纤维围成管道样结构。DNA浓度测定结果显示冻干猪去细胞肝脏支架上残余量为7. 41 ±0. 88 ng/mg (n=3)。PAS染色可见紫红色物质残余,证实组织中存在的糖原和其他多糖物质。扫描电镜可见大量纤维编制成网状结构及管状结构。免疫荧光染色检查提示支架上包含有大量的Ⅰ、Ⅳ、弹性蛋白、层粘连蛋白及纤维连接蛋白残余。LC-MS/MS实验支架上除了保留支架上固有的蛋白成分,还保留了多种糖蛋白成分。sGAG试剂盒测定结果显示冻干猪去细胞肝脏支架上残余sGAG明显高于冻干的猪去细胞化心脏支架上的sGAG含量(23.766± 0.423ug/mg vs 14.519± 0.328 ug/mg3,P<0.05, n=3)。结论:使用尿激酶联合化学去垢剂等灌注液制备猪尸肝去细胞化肝脏支架的方法是切实可行的。该方法可有效地去除组织中包含的细胞成分,同时可以保留支架上的细胞外基质成分,具有良好的组织相容性好,可以作为肝脏组织工程的备选支架材料。第二章利用猪去细胞化肝脏支架制备肝细胞特异性培养基质目的:肝细胞脱离体内生长环境后其功能迅速降低。因此,体外重建肝细胞生长微环境是体外培养、扩增肝细胞的重点。去细胞化支架保留了组织、器官中的大部分细胞外基质成分,包括特异性的胶原组合、S-GAG及生长因子等成分,理论上是最适合细胞生长的生物支架材料。本研究拟通过将猪去细胞化肝脏支架加工成一种肝细胞特异性培养基质成分,再通过肝细胞的特意性培养,比较其与其它组织来源的去细胞基质及Ⅰ型胶原培养基质对于肝细胞增殖及功能影响的差异性,进而证实猪肝脏去细胞化支架培养基质对于肝细胞的特异性效果。方法:以猪尸肝去细胞化肝脏支架作为研究对象,以猪心脏去细胞支架及Ⅰ型胶原溶液作为对照,先后使用尿激酶溶液、SDS溶液及DNA酶等溶液对猪肝、心脏组织切片进行去细胞化处理。再经过冻干、粉碎及Pepsin-HCl消化48h后成为胶样基质溶液。通过SDS-PAGE实验及sGAG测定验证猪肝脏基质、心脏基质及Ⅰ型胶原之间的成分差异,通过圆二色光谱实验验证猪肝去细胞化基质成分中胶原蛋白的活性。最后通过C3A细胞的特异性培养比较三种基质成分在培养过程中对于细胞增殖、形态及功能方面的差异情况。结果:猪肝脏、心脏组织切片经过36h处理后脱细胞完全,经含有胃蛋白酶的稀盐酸溶液48h后形成乳白色粘稠液体,再经过NaOH及10PBS溶液配平后即作为细胞培养基质。使用sGAG试剂盒测得去细胞化肝脏支架培养基质中含有sGAG含量明显高于去细胞化心脏支架培养基质中的含量(14.28±0.127ug/mg vs 12.373± 0.125ug/ng,P<0.05,n=3)。细胞培养实验结果显示:通过AnnexinV细胞凋亡检测实验发现C3A细胞在猪去细胞化肝脏支架培养基质上生长第5天时正常细胞所占到的比例高于在心脏支架基质及Ⅰ型胶原上生长的比例;另外,无论是早期凋亡细胞数比例还是晚期凋亡细胞数比例,猪去细胞肝脏支架基质上的都明显低于在去细胞化猪心脏支架基质及Ⅰ型胶原基质上的细胞。通过Q-PCR及白蛋白、尿素的分泌情况来评价三种细胞培养基质对于细胞的影响。我们发现从第2天到第7天,C3A细胞培养在去细胞化肝脏支架培养基质上分泌Albumin及Urea的量明显高于细胞在去细胞化心脏支架基质及Ⅰ型胶原基质上的分泌量(P<0.05, n=3)。测定Albumin、G6PD及CYP3A4三种分子的细胞表达水平,结果发现C3A细胞在猪去细胞化肝脏支架基质上表达Ammbumin、G6PD及CYP3A4三种分子的水平明显高于细胞在去细胞化心脏支架基质及Ⅰ型胶原基质上的表达水平(P<0.05,n=3),而去细胞化心脏支架基质及Ⅰ型胶原基质两者之间无明显的差异(P>0.05,n=3)。结论:使用猪肝脏去细胞化支架制备的基质溶液保留了肝脏原始支架中大部分蛋白及多糖成分,这种基质铺板后用于C3A细胞的培养,能够促进肝肿瘤细胞系C3A细胞的增殖及功能维持。说明利用去细胞化肝脏支架制备的基质能够用于肝细胞的体外扩增。