背景：椎间盘退变是导致脊柱解剖和功能紊乱的重要原因,是一系列脊柱退行性疾病的病理基础。随着人口老龄化以及人们生活节奏的加快,由其所致的脊柱疾患发病率越来越高,对个人、家庭及社会造成了沉重的负担。因此,有关椎间盘退变性疾病的治疗研究得到越来越多的关注,成为多学科的研究热点。尽管国内外对椎间盘退变的发生、发展及治疗进行了广泛而深入的基础和临床研究,但由于椎间盘退变是多因素参与的复杂过程,目前临床上既无有效的方法阻止其发生和发展,又无理想的措施来对椎间盘退变本身进行合理的治疗。传统的治疗方法包括保守治疗及手术治疗,保守治疗以对症治疗为主,疗效有限；手术治疗包括单纯髓核摘除或者化学溶解髓核组织、人工椎间盘置换等,因退变而致的脊柱不稳采用植骨融合等。这些方法在一定程度上缓解了椎间盘退变性疾病(IDD)引起的的症状,但同时也造成脊柱解剖结构和稳定性的破坏,从而导致节段活动功能的丧失,加重邻近节段的退变,并可能引起许多其他并发症,且远期效果仍不确切。大量研究认为椎间盘退变始于髓核,髓核的退变在于髓核细胞数量减少及活力下降,进而分泌细胞外基质减少,细胞外基质减少导致髓核含水量减少,髓核的弹性及缓冲压力的能力减退,椎间盘高度降低,纤维环所受压力增大,严重者可致纤维环变形、撕裂形成椎间盘突出或脱出。因此,以髓核为突破口,研究退变髓核的修复方法,或许是修复退变椎间盘的关键。近年来,随着国内外组织工程技术和方法的不断发展与创新,通过利用组织工程技术构建具有生物学功能的髓核,或许将为椎间盘退行性疾病的治疗带来新的希望。目前以下髓核组织工程支架研究较多,主要包括：1.人工合成材料支架,如PLA, PGA,明胶等；2.单一天然成分材料,如透明质酸,二型胶原,壳聚糖等,3.人工-天然复合成分材料,如明胶-壳聚糖复合支架等。以上支架仍存在诸多不足,因为天然髓核成分复杂,很难完全模拟其微结构、基质成份及微环境,而去细胞基质非常接近于正常髓核,在某些领域已研究较深入,取得重大进展,例如在膀胱、血管、真皮、心瓣膜等取得较大成功并被批准用于临床,在软骨方面亦有不少研究。但在组织工程髓核领域,检索国内外文献鲜有报道,我们猜想以去细胞髓核基质为材料来源的支架是不是同样能成功构建组织工程髓核?并在此基础上,将种子细胞接种至去细胞兔天然髓核支架,进行体外构建组织工程髓核。参考国内外相关文献,脱细胞的方法很多,有酶消法、冷冻干燥法、去污剂处理法等,我们前期进行了大量的预实验,总结出一套理想的兔髓核脱细胞方法；但是我们发现单纯脱细胞后获得的兔髓核去细胞基质存在明显缺陷,即结构致密,孔隙率及孔径均很不理想。故我们在脱细胞基础上创新,进一步采用物理粉碎、溶解、离心、冷冻干燥成型、物理化学交联等一系列处理制得去细胞髓核基质来源三维多孔支架,它去除了髓核细胞及一些小分子免疫源性蛋白,因此具有良好的生物相容性,以及更低的细胞毒性,基本保留了天然髓核的原有细胞外基质成分及局部微环境。它呈三维立体结构,拥有较好的力学性能及细胞所需微环境,并有理想的孔隙率及合适大小的孔径,非常有利于种子的粘附、迁移。兔髓核取材方便,大小合适,国内外制作兔椎间盘退变模型的方法成熟,已成为髓核组织工程研究的经典模型。骨髓间充质干细胞是一类广泛存在于造血系统具有多向分化能力的成体干细胞,取材简便,来源较广,易于体外增殖,抗原性小,能够基因修饰及多向分化,组织修复能力强等,国内外文献都有报道利用骨髓间充质干细胞向类髓核细胞成功分化,因此是一种理想的种子细胞。目的：利用去污剂-核酸酶法脱细胞获取去细胞髓核基质,进一步物理粉碎、溶解、离心、冷冻干燥成型、物理化学交联、辐照消毒制备去细胞兔髓核基质来源三维多孔支架；接种骨髓间充质干细胞至去细胞髓核基质来源三维多孔支架,体外模拟椎间盘生理低氧环境,含TGF-β1培养基诱导培养以获取组织工程髓核；移植复合体至裸鼠皮下,观察及评价复合体在体内环境生长情况。通过组织病理学、生物化学、分子生物学技术评价支架脱细胞情况及复合物内细胞增殖、迁移、细胞外基质分泌情况,通过生物力学评价支架及支架-种子细胞复合体的生物力学特性；通过肉眼观察支架及复合体的宏观结构,扫描电镜观察微观结构,并通过荧光定量分析样本DNA总量评判细胞在支架内的增殖情况,实时荧光定量分析聚集蛋白聚糖及二型胶原mRNA含量,综合评价去细胞髓核基质来源三维多孔支架的性能以及其应用于髓核组织工程的可行性。方法：1.兔髓核去细胞基质来源三维多孔支架的制备。选取36只2.5-3kg的新西兰大白兔做为髓核组织的供体来源,采用去污剂-核酸酶法对兔髓核组织进行脱细胞处理,根据课题组前期研究总结出的方案有效去除髓核细胞,且细胞外基质成分损失较少。在原有脱细胞方案处理后进行创新,进一步将去细胞髓核基质采用物理粉碎、溶解、离心、冷冻干燥成型、物理化学交联、辐照消毒等一系列处理制得去细胞髓核基质来源三维多孔支架。通过HE染色、DAPI染色判断脱细胞程度,电镜下观察支架形态结构、孔径大小及空隙密度。通过吸水试验测定支架吸水率及孔隙率。通过配置不同浓度支架浸提液及完全培养基(空白对照)培养兔骨髓间充质干细胞,通过细胞增殖情况判断支架的细胞毒性。2.接种骨髓间充干细胞至去细胞髓核基质来源三维多孔支架进行体外诱导培养。通过添加TGF-β1等配置诱导培养基,并将细胞-支架复合体置于5%O2,5%CO2的厌氧培养箱中分别诱导培养4天、2周、4周。肉眼观察细胞-支架复合体大体形态变化；通过荧光定量法检测复合体DNA总量以判断细胞增殖情况；诱导培养后4天,电镜观察细胞-支架复合体中细胞在支架上的黏附、增殖、迁移及细胞外基质分泌情况；通过活死细胞染色法观察细胞在支架的存活情况；分别取出2周、4周组的细胞-支架复合体,通过HE染色、DAPI染色、阿利新兰染色、二型胶原免疫组化染色等病理组织学技术,以及二型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA实时荧光定量等分析体外培养复合体的形态变化,细胞增殖、分化及细胞外基质分泌情况。3.将部分在体外诱导培养2周后的细胞-支架复合体以及去细胞髓核基质来源三维多孔支架(空白对照组)移植入4周龄大小的裸鼠皮下肌膜层,取复合体移植4周后的裸鼠行活体成像检测；分别取出移植2周、4周的复合体样本进行观察。包括通过肉眼观察细胞-支架复合体大体形态变化；通过HE染色、DAPI染色、阿利新兰染色、二型胶原免疫组化染色等病理组织学技术,以及二型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA实时荧光定量分析等评价体内移植物的形态变化,细胞增殖、分化及细胞外基质分泌情况。结果：第一部分：去细胞髓核基质来源三维多孔支架的大体观及基本特征。肉眼观见支架呈圆柱状,乳白色,富有弹性,类似海绵,光学显微镜下可见支架为多孔结构,孔隙相互贯通,交界处结合紧密,中央脱细胞髓核基质微丝相互连接,形成网状结构。通过吸水试验测定的细胞吸水率为272.16±33.30%,孔隙率为81.28±4.10%。电镜下孔隙相互贯通,空隙直径在100-450um之间。HE染色结果显示细胞外基质淡红染,细胞核及细胞残留物去除较为彻底,DAPI染色显示几乎无细胞核残留,表明脱细胞髓核基质来源三维多孔支架细胞去除彻底,拥有良好的三维立体结构及理想的吸水率、空隙率及孔径大小。第二部分：体外培养的骨髓间充质干细胞-支架复合体的性能评估。肉眼下细胞-支架复合体随培养时间延长,复合体体积缩小,质地变得更加致密,2周左右形成一个实心圆饼状的类髓核组织。扫描电镜下观察接种兔骨髓间充质干细胞4天的细胞-支架复合体,将支架横行切割成2份,复合体表面及横截面均可见细胞大量粘附在支架微丝结构中,多数呈扁平状,少数呈不规则型或圆形。活死细胞染色观察体外培养的细胞-支架复合体结果表明种子细胞在支架上存活良好,且分布均匀,死亡细胞极少；DNA荧光定量分析结果表明样本DNA含量增加呈时间依赖性；将体外诱导培养的复合体样本切片HE染色、DAPI染色结果显示种子细胞随培养时间延长,细胞数量增加,细胞外基质分泌增加。阿利新蓝染色、二型胶原免疫组化染色均表明随培养时间延长,细胞外特异性髓核基质成分糖胺聚糖及二型胶原分泌逐渐增加。复合体及单纯支架(空白对照)弹性模量显示随培养时间延长,复合体弹性增加,但均与正常髓核弹性模量存在差异,其中培养4周后的复合体弹性接近正常。实时荧光定量分析结果表明聚集蛋白聚糖及二型胶原mRNA分泌量呈时间依赖性增加。第三部分：体内种植的骨髓间充质干细胞-支架复合体的性能评估。移植入裸鼠皮下肌膜的复合体样本切片HE染色、DAPI染色结果显示种子细胞随培养时间延长,细胞数量增加,细胞外基质分泌增加。阿利新蓝染色、二型胶原免疫组化染色均表明随培养时间延长,细胞外特异性髓核基质成分糖胺聚糖及二型胶原分泌逐渐增加。同样实时荧光定量分析结果表明聚集蛋白聚糖及二型胶原mRNA分泌量呈时间依赖性增加。结论：1.骨髓间充干细胞来源稳定,增殖快,可在含TGF-β1的诱导培养基及低氧环境中分化为类髓核细胞,并分泌大量髓核细胞外基质,可以作为理想的种子细胞来源；2.利用去污剂-核酸酶法可以有效去除髓核细胞,且对细胞外基质损耗小,利用粉碎、冷冻干燥、物理化学交联可以成功制备髓核去细胞基质来源三维多孔支架,该支架具有疏松多孔立体结构,生物力学性能良好,无细胞毒性,且保留了大部分髓核细胞外基质成分,可以作为髓核组织工程的支架来源；3.骨髓间充质干细胞复合髓核去细胞基质来源三维多孔支架,在低氧条件下,置于含TGF-β1诱导培养基中体外培养,可成功向类髓核细胞分化、增殖；4.兔骨髓间充干细胞复合髓核去细胞基质来源三维多孔支架裸鼠体内种植,种子细胞在支架内大量增殖,细胞分布均匀,部分形成簇状结构,且大量分泌合成髓核特异性基质蛋白聚集蛋白聚糖及二型胶原,活体成像显示体内种植4周后复合体仍然强荧光,表明种子细胞存活良好,且移植物形态致密,富有弹性,类似髓核组织,故兔骨髓间充干细胞复合髓核去细胞基质来源三维多孔支架在裸鼠体内成功分化为类髓核组织。