论文部分内容阅读
猪乙型肝炎病毒(Hepatitis B liked Virus of swine,swHBV)和猪戊型肝炎病毒(Swine Hepatitis E Virus, sw HEV)是当今影响人和动物健康的两种重大人畜共患传染病,两病的广泛流行和蔓延已给人类和动物的健康造成了严重威胁。在现代化规模养猪场中,HBV与HEV往往混合感染,发病率呈上升趋势。为了了解这两种病原在猪群中的感染状况及病原特征,本实验以HBV和HEV当地流行毒株为研究材料,进行了流行病学调查、基因克隆、基因图谱绘制、分子结构特征分析、分子诊断及免疫研究,主要研究成果如下:1.应用ELISA技术,对兰州及周边地区的屠宰场、养殖场和散养猪采集血样976份,进行流行病学调查,并对猪HBV进行检测。结果如下:(1)猪类乙肝的各项检测结果显示,猪群中类乙肝阳性率较高,其中大三阳和小三阳率总体占到1.5%,病毒发现复制(e抗原)的猪占5.9%;产生抗体(表面抗体)的猪达16%。(2)在甘肃的靖远和景泰地区猪类乙肝的阳性率比较高,分别达到25.7﹪和20.5﹪。(3)八月龄以上的猪与八月龄以下的猪相比,类乙肝阳性率偏高,分别为14.6﹪和4.5﹪。(4)泔水猪比集约化猪场猪乙类肝阳性率高,分别为23.2﹪和5.9﹪。2.分段克隆了swHBV的S、C、P基因片段,绘制基因图谱和系统进化树,结果表明,扩增的swHBV-S基因长251bp,与国内外参考毒株CHN-QH5、Tibet127等12个毒株核苷酸序列的同源性分别为99.0%～99.6% ,其中与CHN-QH38株遗传距离较近;扩增的swHBV-C基因长550bp,与国内外参考毒株SK300、NSS-2等12个毒株核苷酸序列的同源性分别为99.0%～99.8%,其中与CHN-L45株遗传距离关系较近;扩增的swHBV-P基因长1414bp,与国内外参考毒株G683-1、S245-A2等10个毒株核苷酸序列的同源性分别为94.8%～95.8%,其中与S245-A2株遗传距离较近;3.采集甘肃、青海部分地区养殖场的猪粪便和胆汁556头份,进行了猪戊型肝炎病毒(swHEV)的RT-PCR检测,粪便和胆汁中猪戊型肝炎阳性率高达4.2%和10.7%。4.设计7对巢氏PCR引物,利用RT-RCR技术,分段克隆了涵盖swCH146株基因组的cDNA片段,并对swHEV146株全基因特征进行了分析,绘制了swCH146株全基因图谱和系统进化树,结果表明,该毒株全基因组长7284bp,与HEVG-4(AJ272108.1)和swCH25(AY594199.1)两株病毒亲缘关系最近,同属于HEV基因IV型,其中与新疆swCH25株同源性最高,达到89.5%。对swCH146株各基因的核苷酸同源性进行分析显示,swCH146株包含3个阅读框(ORF1、ORF2、ORF3),swHEV146株ORF1与己报道的HEVⅠ型株(D11093 )、Ⅱ型mexican strain株( M74506.1)和Ⅲ型SWKOR-2株(FJ426404)的ORF1核苷酸同源性分别为87.5%、83.2%和91.0%,而与Ⅳ型KNIH-hHEV4株(FJ763142.1)的同源性高达97.2%;swHEV146株ORF2与以上I～III型毒株的核苷酸同源性分别为92.6%、92.4%和94.9%,与IV型KNIH-hHEV4株同源性为98.9%;swHEV146株ORF3与以上I～III型毒株的核苷酸同源性分别为87.5 %、90.0%和90.6%,与IV型KNIH-hHEV4株同源性为98.4%。5.构建了HEV swCH146株ORF2的重组腺病毒质粒,转染AD-293细胞,经荧光检测表明获得了AD-E复制缺陷型腺病毒。该项研究为swHEV重组腺病毒疫苗的研制奠定了良好的基础。