1.研究背景与目的胰岛移植是目前临床治疗终末期T1DM的有效方法之一,但是为提高胰岛移植的效果,尚有许多需要解决的问题;其中免疫损伤、缺氧/复氧损伤效应、非特异性炎症反应及细胞凋亡等引起的移植物功能丧失,是目前胰岛移植治疗面临的最大障碍。移植胰岛的生存及功能维持依赖充足的营养供应及血氧,而再血管化过程的延迟和不充分将导致胰岛死亡及早期功能丧失;因此,早期快速和充分的血管重建对移植胰岛具有重大的意义。氧供的下降将导致缺氧诱导因子HIF的定植及活化,继而引发血管内皮生长因子（VEGF）的转录。虽然移植胰岛再血管化的分子机制尚不完全清楚,但可推测胰岛细胞是VEGF来源组成,而VEGF是启动再血管化及维持移植物血管通透性的重要因素。探究通过何种途径来改善胰岛移植中胰岛细胞缺氧/复氧造成的损伤以及再血管化对其的影响是改善移植效果的关键。SST的生理功能由细胞膜上的生长抑素受体（somatostatin receptor,SSTR）介导,SSTR是一种具有7个跨膜区段的糖蛋白,目前已确认SSTR有5种不同的分子亚型SSTR1⁵。有报道指出,SST可与PACs上的SSTR作用,直接抑制胰腺分泌和淀粉酶分泌,SSTR2激活时,可通过调节细胞电生理活动、调控离子通道抑制胰酶的合成和分泌。本课题组前期初步研究表明将胰腺外分泌细胞和胰岛细胞共同移植到糖尿病小鼠左肾被膜下,移植胰岛的功能恢复会因受到分泌及释放的胰淀粉及胰蛋白酶的破坏而推迟,但具体机制尚不明确。本研究首先分别探讨在常氧/缺氧条件下奥曲肽（OCT）在体外对胰腺腺泡细胞（AR42J细胞）和胰岛β细胞（Min6细胞）生长活力及细胞凋亡的影响,进一步分析其对两种细胞VEGF蛋白表达和缺氧诱导因子HIF-α蛋白表达的作用,初步阐明奥曲肽在胰腺腺泡细胞和胰岛细胞应用的意义;进而通过建立糖尿病小鼠胰岛及胰腺外分泌细胞共同移植动物模型,然后在移植术后应用奥曲肽,深入探讨其可能作用机制,旨在为阐明奥曲肽对移植胰岛功能恢复的影响提供理论基础和新的依据。2.方法2.1胰腺外分泌细胞（AR42J）培养后分为实验组及对照组,实验组予奥曲肽干预,然后分别在常氧/缺氧条件下培养,奥曲肽药物与对照组胰腺外分泌细胞分别采取CCK8法检测细胞的生长活力,用ELISA检测两组细胞培养上清中VEGF蛋白的表达差异,用蛋白印迹法检测实验组及对照组缺氧诱导因子HIF-α蛋白的表达差异,通过流式细胞技术检测奥曲肽干预组及对照组对胰腺外分泌细胞凋亡的影响。2.2通过qPCR检测不同CoCl₂浓度药物作用min6细胞后目的基因HIF-1α的表达,摸索药物CoCl₂不同浓度作用min6细胞对目的基因HIF-1α表达的影响,以能诱导高表达HIF-1α的CoCl₂药物浓度制备min6细胞缺氧阳性对照组。胰岛β细胞（min6）培养后分为实验组及对照组,实验组予奥曲肽干预,然后分别在常氧/缺氧条件下培养,奥曲肽药物与对照组胰岛β细胞分别采取CCK8法检测细胞的生长活力,用ELISA检测两组细胞培养上清中VEGF蛋白的表达差异,用蛋白印迹法检测实验组及对照组缺氧诱导因子HIF-α蛋白的表达差异,通过流式细胞技术检测奥曲肽干预组及对照组对胰岛β细胞凋亡的影响。2.3 C57BL/6小鼠麻醉之后通过胰胆管原位逆行灌注低温V型胶原酶使胰腺膨胀,然后用10771淋巴细胞分离液低温离心层析出胰岛,在倒置显微镜下用200μl微量移液枪手工挑取胰岛,分离纯化胰岛的数量及纯度采用双硫腙特异性染色检测。将胰岛用4%胰蛋白酶消化为单个细胞后进行台盼蓝染色,进而计算胰岛细胞的活性;采用ELISA法检测获得胰岛在低糖刺激和高糖刺激的胰岛素分泌量,通过胰岛素刺激指数来判断胰岛功能。胰腺外分泌细胞分别培养1h,4h后收集其上清液用ELISA法测胰蛋白酶相对表达量。2.4 C57BL/6小鼠在胰岛移植或手术前1周采取经腹腔注射链脲佐菌素的方法将其诱导成糖尿病小鼠。然后随机分为胰岛及胰腺外分泌细胞共同移植组（n=10）、移胰岛植组（n=10）和假手术组（n=10）。术后经尾静脉取血通过罗氏血糖仪检测各组小鼠不同时间段的血糖值,术后第14天,从假手术组随机挑选5只糖尿病小鼠,并从单纯移植组、共同移植组中糖尿病被治愈的C57BL/6小鼠中分别随机挑选5只,分别作为假手术组,单纯移植组与共同移植组,予行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）,比较各组小鼠胰岛对葡萄糖耐量的耐受性差异。术后28天切除单纯移植组及共同移植组C57BL/6小鼠的左肾,各组左肾被膜下移植物通过免疫化学染色法检测其胰岛素及胰蛋白酶的表达差异。2.5 C57BL/6雄性糖尿病小鼠48只,完全随机化分实验组（共同移植组+奥曲肽干预n=24）和对照组（共同移植组n=24）。用胶原酶V消化分离胰岛及胰腺外分泌细胞。1%戊巴比妥钠按0.01ml/g行腹腔内注射麻醉小鼠。糖尿病小鼠左肾被膜下的上极和下极分别移植200个胰岛及等体积的胰腺外分泌细胞。术后检测实验组及对照组小鼠不同时间段血糖变化;并于移植术后第21天,对实验组和对照组中糖尿病被治愈的小鼠,分别行IPGTT试验比较两组小鼠糖耐量差异性。实验组及对照组受鼠胰岛移植术后第1、3、7、14天各随机挑选3只小鼠切除含有移植物的左肾行病理学检查。术后7天,实验组及对照组左肾被膜下移植物进行胰岛素和α-淀粉酶双染免疫荧光检测,探讨其胰岛素及淀粉酶的表达差异;两组术后早期（第1,3,7,14天）切除的左肾被膜下移植物分别通过免疫组化检测P53、Bax蛋白表达差异,TUNEL法检测移植胰岛的凋亡情况,EDU和insulin双染免疫荧光检测胰岛细胞增殖方面的差异。3.结果3.1体外实验研究表明,浓度10^-8M奥曲肽对AR42J细胞增殖有一定促进作用。奥曲肽在缺氧条件下起到抑制胰腺外分泌细胞血管内皮生长因子VEGF和缺氧诱导因子HIF-1α表达的作用。通过流式细胞仪检测奥曲肽组及对照组在常氧/缺氧状态下对胰腺外分泌细胞凋亡,结果显示:常氧状态下奥曲肽能明显抑制胰腺外分泌细胞凋亡（P<0.05）,且缺氧条件下,奥曲肽亦能在一定程度下促进胰腺外分泌细胞凋亡（P<0.05）。在常氧条件下奥曲肽能减少胰腺外分泌细胞（AR42J）的坏死（P<0.05）,在缺氧条件下对细胞坏死无影响。3.2按浓度为400μmol/l的CoCl₂药物作用min6细胞12h制备缺氧阳性对照组细胞,CCK-8检测结果表明体外应用奥曲肽（OCT）处理胰岛β细胞（min6）后常氧/缺氧条件下均存在一定程度抑制细胞增殖作用。缺氧组与正常氧组min6细胞培养9小时后收集上清行ELISA检测发现其VEGF相对表达量无差异（P>0.05）。常氧条件下,阴性对照组（无OCT组）VEGF相对表达量与OCT共培养组无差异（P>0.05）,也即在常氧情况下OCT作用min6细胞后对VEGF表达无明显影响。而缺氧条件下,VEGF相对表达量无OCT组比OCT共培养组高（P<0.05）,说明在缺氧情况下OCT作用min6细胞后可下调VEGF蛋白表达。流式细胞技术检测细胞凋亡结果显示:常氧条件下,对照组及奥曲肽组细胞凋亡率为3.52±0.31%VS5.20±0.38%;缺氧状态下,对照组及奥曲肽组凋亡率约分别为11.40±0.62%,6.12±1.07%。常氧条件下,对照组与奥曲肽组细胞凋亡率差别无统计学（t=4.203,P>0.05）,说明奥曲肽在常氧情况下对min6细胞凋亡无影响。而在缺氧状态下,奥曲肽组比对照组细胞凋亡率低,差别具有统计学意义（t=5.803,P<0.05）,说明奥曲肽在缺氧条件下能抑制min6细胞凋亡,这对移植胰岛功能恢复是一个保护作用机制。3.3沿胆胰管原位逆行灌注低温V型胶原酶消化液分离胰岛,平均每只C57BL/6小鼠被获得（130±20）个高质量胰岛,活性及纯度均大于90%。低糖（2.8mmol/L葡萄糖）刺激胰岛素释放量为（0.458±0.086）ng/胰岛,高糖（16.7mmol/L葡萄糖）刺激胰岛素释放量为（0.955±0.122）ng/胰岛,胰岛素刺激指数为2.08。这表明分离提纯出的胰岛功能是好的。ELISA法检测胰腺外分泌细胞培养1h,4h后收集的上清液中胰蛋白酶含量,结果分别为（4.283±0.289）ng/ml、（5.435±0.203）ng/ml。3.4糖尿病小鼠胰岛移植术后两组受鼠血糖均逐步下降,单纯行胰岛移植组小鼠的平均血糖值恢复正常所需时间比胰岛及胰腺外分泌细胞共同移植组小鼠平均血糖值恢复正常所需的时间少（P<0.05）。术后血糖浓度>11.1mmol/L的糖尿病小鼠比率,单纯移植组低于共同移植组（P<0.05）。切除左肾后3天,单纯移植组及共同移植组受体鼠血糖均>21mmol/L,出现糖尿病复发。而假手术组糖尿病小鼠手术前后血糖波动不明显。切除的两组小鼠左肾肾被膜下移植物行免疫组化检测结果发现抗胰岛素抗体阳性显色,提示为移植的胰岛。而抗胰淀粉酶抗体免疫组化检测结果发现在共同移植组胰岛细胞团周围存在较多的阳性颗粒,而单纯胰岛移植组无明显的阳性颗粒。3.5在C57BL/6糖尿病小鼠左肾被膜下的上极和下极分别进行胰岛和胰腺外分泌细胞共同移植术后,奥曲肽组和对照组受鼠血糖浓度均逐步降低。奥曲肽组的糖尿病小鼠术后随机血糖浓度平均值达正常血糖水平所需要的时间为胰岛移植术后10天,而对照组的糖尿病小鼠所需要的时间为胰岛移植术后14天（P<0.05）。术后21天,腹腔糖耐量实验IPGTT结果表明,奥曲肽组在不同时间点的血糖值低于对照组（P<0.05）,结合曲线下血糖面积的比较结果（P<0.05）,表明实验组小鼠对糖耐量试验的耐受性高于对照组。术后7天,左肾被模下移植物经抗胰岛素抗体和抗α-淀粉酶双染免疫荧光检测证实移植物为移植的胰岛细胞且可正常分泌胰岛素,奥曲肽组胰岛存活率较对照组高;术后第1天奥曲肽组P53、Bax表达较对照组明显高（P<0.05）。术后第3及第7天奥曲肽组糖尿病小鼠与对照组糖尿病小鼠在P53表达水平方面组间比较无差异（P>0.05）,但奥曲肽组小鼠的Bax相对表达量低于对照组小鼠的Bax相对表达量（P<0.05）,说明奥曲肽能够抑制移植胰岛的凋亡。EDU和insulin双染免疫荧光病理检测结果显示胰岛移植术后第1、3、7天实验组及对照组均未发现胰岛β细胞增殖,而术后14天检测的结果显示移植的胰岛β细胞发生增殖,其中奥曲肽组平均每张切片为增值率为13.9%±1.2%,对照组为5.8%±0.6%（P<0.05）。4.结论4.1体外实验表明,奥曲肽对AR42J细胞增殖有一定促进作用;而对胰岛β细胞（min6）细胞存在一定程度抑制细胞增殖作用。4.2在缺氧状态下,胰腺外分泌细胞（AR42J）的VEGF蛋白表达上调。应用奥曲肽能抑制AR42J细胞血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达,且能下调缺氧诱导因子（HIF-1α）蛋白的表达。奥曲肽在缺氧条件下可能起到促进AR42J凋亡的作用,而对其细胞坏死无明显影响。4.3在缺氧条件下,奥曲肽能下调min6细胞VEGF蛋白的表达。min6细胞的HIF-1α蛋白在缺氧条件下的相对表达量比常氧状态高,而常氧/缺氧条件下奥曲肽均能提高胰岛β细胞（min6）HIF-1α蛋白的表达。而HIF-1α高表达可能对移植胰岛再血管化起重要作用。本研究通过流式细胞仪凋亡检测首先发现在缺氧条件下,奥曲肽能够抑制胰岛β细胞（min6）的凋亡。4.4通过胰胆管内逆行灌注低温V型胶原酶消化胰腺,结合单一浓度梯度10771淋巴细胞分离液低温离心层析分离小鼠胰岛,可以获得高纯度、高质量的胰岛。4.5以160mg/kg腹腔注射STZ能够成功诱导C57BL/6糖尿病鼠模型。通过在其左肾被膜下的上极和下极分别移植胰岛及胰腺外分泌细胞,成功建立胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植糖尿病小鼠模型。4.6对以C57BL/6糖尿病小鼠建立的胰岛和胰腺外分泌细胞共同移植模型的体内研究发现,奥曲肽可促进移植胰岛功能恢复,减少糖尿病小鼠血糖恢复正常所需的时间;提高胰岛移植后血糖恢复正常的小鼠的胰岛β细胞对葡萄糖耐量试验的耐受性;并能抑制移植胰岛凋亡和促进其增殖。我们推断其机制一方面是可能与用奥曲肽后P53表达上调促进早期胰岛损伤修复和Bax表达下调抑制移植胰岛β细胞凋亡有关;另一方面可能与奥曲肽在胰岛移植早期缺氧状态能够下调胰岛β细胞VEGF表达,从而减少胰岛早期ATP耗能,有利于提高胰岛存活有关。同时奥曲肽能促进HIF-1α蛋白的表达上调,亦可能在移植胰岛的再血管化及细胞增殖方面起到重要作用。而且奥曲肽在缺氧条件下促进胰腺外分泌细胞凋亡能减轻其对移植胰岛的损害。