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三七是我国的传统名贵中药材,其总皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇及提高机体免疫力等多种生物活性,是预防心脑血管疾病的重要药物。其种植区域主要分布于我国云南省,三七独特的生长环境易诱发多种病害的发生,尤其是真菌病害,其中主要由茄腐镰刀菌引起的根腐病是三七的主要病害。根腐病常年发病率为5%-20%,严重的高达70%以上,严重影响了三七原药材的产量和品质。前期研究发现,外源茉莉酸甲酯预处理三七可明显提高其对茄腐镰刀菌的抗性,因此本研究利用高通量测序技术,分别对茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和无菌水预处理三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]受茄腐镰刀菌[Fusarium solani(Mart.)Sacc]侵染后的三七根进行转录组测序及基因表达谱分析。此外,还克隆了响应茉莉酸的三七抗病相关基因PnMAPKK1,并分析了它的表达特性及功能。本论文的开展有助于深入认识三七与茄腐镰刀菌的分子互作及茉莉酸信号途径介导三七抗茄腐镰刀菌的分子机制。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1.转录组测序共产生了 179.007 M 高质量 reads(9.13 G bases,Q30>90%),聚类分析产生了 198358条转录本(length≥200bp,N50 Length of 1766bp),序列分析共获得了 80834 个 unigene(N50 of 1055 bp)。使用 COG、GO、KEGG、Swissprot、nr以及NCBI等数据库对所有unigene进行注释,其中36771个unigene能在一个或多个数据库找到相应的同源序列。然后以整合的unigene库为参考对12个文库的转录组reads进行作图分析,每个文库中大于90%的reads只与单一转录本map,多重map reads的比率低于10%。2.以无菌水处理三七为对照比较了 MeJA处理三七根部24 h后的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),共获得了 1 108 个 DEGs,其中 692 个为上调基因,416个基因表达下调。此外,分别以无菌水和MeJA处理三七为对照,分析两组三七受茄腐镰刀菌侵染后的差异表达基因。接种茄腐镰刀菌4 h、12 h、24 h、48 h时,MeJA预处理组中上调的差异表达基因数目变化不大,均在500个左右。接种后72 h,MeJA预处理组中产生了 3680个DEGs,其中3042个DEGs表达上调,相反地,无菌水预处理组的DEGs数量不到MeJA处理组的三分之一,并且多数基因表达受抑制。对不同比较组合的DEGs进行维恩作图,发现大量受MeJA调控的DEGs也响应茄腐镰刀菌侵染。3.对差异表达基因进行KEGG pathway注释和富集分析,发现萜类骨架生物合成途径基因以及植物-病原体互作相关基因显著受外源MeJA处理的调控。接种茄腐镰刀菌后4 h,更多植物激素信号转导相关基因在无菌水预处理三七根中受调控,相似地,大量植物激素信号转导以及植物-病原体互作相关基因于接种后12 h在无菌水预处理三七根中差异表达。至接种后24 h,无菌水预处理根中大量与核糖体、内质网蛋白加工、氧化磷酸化等途径相关的基因差异表达。然而,在接种后48 h以及72 h,更多与核糖体、苯丙烷生物合成、植物激素信号转导、植物-病原体互作等途径相关的基因在MeJA预处理三七根中受调控。4.依据测序结果,挑选了 18个差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果表明,qRT-PCR结果与转录组测序和基因表达谱分析的结果一致,除过氧化氢酶及过氧化物酶外,其余基因均响应外源MeJA预处理,同时它们的转录水平还受茄腐镰刀菌的诱导。而在对照三七中,这些基因的表达量或远低于MeJA预处理三七中的表达量,或诱导表达的时间较MeJA预处理三七明显推迟。qRT-PCR的结果无疑表明转录组测序及基因表达谱分析能揭示JA信号途径介导三七抗茄腐镰刀菌的分子机理,并可高效发掘三七中响应JA的相关抗病功能基因。5.基于转录组测序产生的编码MAPKK的差异表达基因序列,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得PnMAPKK1的全长 cDNA,并对其进行表达特性及生物信息学分析。PnMAPKK1全长为960 bp,编码一个具有319个氨基酸的蛋白质。荧光定量PCR(quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR)分析结果表明PnMAPKK1的转录水平受茄腐镰刀菌侵染和茉莉酸甲酯、水杨酸(salicylic acid,SA)、乙烯(ethylene,ETH)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)4种信号分子的诱导。将融合基因表达载体pBIN m-gfp5-ER-PnMAPKK1转入根癌农杆菌EHA105中,侵染洋葱表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察发现PnMAPKK1定位在细胞质中。构建PnMAPKK1植物超表达载体pCAMBIA2300S-PnMAPKK1转入烟草中过表达,并培育获得T2代转基因烟草。qRT-PCR分析结果表明,PnMAPKK1在转基因烟草中稳定地表达,与野生型烟草相比,PnMAPKK1转基因烟草T2代植株增强了对茄腐镰刀菌侵染的抗性。在茄腐镰刀菌侵染的过程中,与野生型烟草相比,PnMAPKK1转基因株系中一些防卫相关基因的转录水平均明显提高,同时PnMAPKK1转基因株系中MeJA、ETH和SA的含量也均明显提高。以上结果表明,利用高通量测序技术对MeJA和无菌水预处理三七感染茄腐镰刀菌后的12个样品进行转录组测序,获得了三七与茄腐镰刀菌的亲和互作过程及MeJA预处理三七与茄腐镰刀菌的不亲和互作过程的基因表达谱差异,有助于揭示外源MeJA调控三七抗茄腐镰刀菌防卫反应的分子机制。PnMAPKK1作为一个新的三七MAPKK基因,其表达受茄腐镰刀菌侵染和外源信号分子处理的诱导。PnMAPKK1过表达可调控转基因烟草叶片中部分防卫相关基因的表达,提高转基因烟草中MeJA、ETH和SA的含量,并增强转基因烟草对茄腐镰刀菌侵染的抗性。因此,作为一个抗病候选功能基因,PnMAPKK1可用于基因工程技术提高植物的抗病性。