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灰飞虱是水稻上非常重要的半翅目害虫,不仅能通过刺吸式口器吸取水稻等作物汁液,掠夺其营养物质,直接危害作物,同时还在水稻、玉米等作物间传播植物病毒,严重影响了水稻、玉米等农作物的安全生产。此类害虫主要依靠化学农药进行防治,但化学农药长期滥用带来了害虫抗药性上升、农药残留、环境污染、食品安全等一系列严重后果,急需开辟新的绿色防控途径。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）已被广泛的应用于多种水稻鳞翅目害虫的绿色防控。近年来,本实验室在大量分离筛选Bt菌株资源的基础上,发现了两株对灰飞虱具有活性的野生菌株,并从中分别克隆了cry64Ba、cry64Ca和cry78Aa三种新基因,这些基因表达产物对灰飞虱均具有很高的毒杀作用。由此说明从Bt菌株资源中筛选新的对飞虱高毒力杀虫蛋白是可行的。本研究在Bt基因组高通量测序基础上,以对灰飞虱高毒力的cry64Ba、cry64Ca和cry78Aa基因为参照,利用生物信息学技术分析挖掘新型Bt杀虫基因,并以灰飞虱为靶标害虫,结合传统的生物活性测定,克隆对灰飞虱具有显著杀虫活性的新基因,为灰飞虱的生物防治提供重要的菌株和基因资源。主要结果如下:（1）利用生物信息学技术,经BLAST比对,从实验室前期完成的1368个Bt菌株草图数据库获得162条cry78Aa1基因同源核苷酸序列,确定了17株含有cry78-like基因的候选Bt菌株。（2）生测结果发现P14E12、B4F11、C8D6、T5D8、B15C9这5株候选菌株总晶体蛋白对灰飞虱具有一定程度的杀虫活性,致死率在40-80%。这些菌株的采集地具有一致性,均来自于北京百望山森林公园。（3）完成了P14E12、B4F11、C8D6、T5D8、B15C9共5株菌株的Bt基因注释,蛋白结构预测发现这些菌株含有的cry78-like基因编码的蛋白均含有RicinB＿lectin和Toxin＿10超家族保守结构域。（4）无活性菌株Bt P14C1、P14F6、C14F11、P10C11、A4A4、B9B3的蛋白样品经胰蛋白酶消化后对灰飞虱的致死率均有所提高,其中C14F11、P10C11两种菌株总晶体蛋白经胰蛋白酶消化前后的活性具有显著性差异。（5）分别从B4F11、A3F10、P10C11、P14F6、T5D8、A4A4、C14F11、P14E12菌株中克隆cry78-like基因共8种,这些基因编码蛋白与Cry78Aa1的氨基酸序列相似性介于31.8-54.3%;在大肠杆菌中成功表达了7种新基因,这些蛋白分子量在41.6-43.7 kDa之间,与预测蛋白分子量大小一致;其中Protein 6、Protein 10、Protein 11三种蛋白可溶性表达,蛋白分子量分别为42.5、43.7、42.4 kDa。生物活性初筛结果显示这三种Cry78-like蛋白对灰飞虱三龄若虫一定程度的杀虫活性,在30μg/mL时校正死亡率分别为90.15%、40.99%、26.23%。（6）选取初筛活性最好的Protein 6蛋白进行深入研究。该蛋白由来源于活性Bt菌株B4F11的gene6编码,包含380个氨基酸残基,预测的分子量约为42.5 kDa,具有Ricin＿B＿Lectin和Toxin＿10超家族保守结构域。其对灰飞虱三龄若虫具有很高杀虫活性,致死中浓度LC50为9.72μg/mL。gene6基因序列已提交给NCBI GenBank,登录号为MN075151,与Cry78Aa1氨基酸相似性为54.3%,被Btδ-内毒素国际命名委员会命名为cry78Ba1,这是第二等级的新基因。（7）Cry78Ba1蛋白与目前已知的过敏原均无序列同源性,在90℃加热10 min即可变性失活。Cry78Ba1蛋白在模拟胃液处理15 s内完全降解失活,但模拟肠液中消化1 h仍具有杀虫活性。由此推测Cry78Ba1蛋白被人或高等动物摄入后在胃液中可被迅速降解短肽,在进入肠道时应当已经丧失了毒性。在本研究测试范围内,就消化和吸收而言,该蛋白没有发现对人类或哺乳动物的安全隐患。综上,本研究基于高通量测序技术获得Bt菌株基因组草图数据以及生物信息学方法比对现有活性基因的同源核苷酸序列,从候选菌株活性筛选、同源基因活性鉴定两方面出发,挖掘对灰飞虱具有高毒性的Bt菌株与基因。这说明,在Bt野生菌株中发现对灰飞虱等刺吸式口器害虫有活性的Bt菌株具有很大的潜力。研究结果为发掘对半翅目刺吸式口器害虫高毒力的Bt菌株及基因提供了新思路;同时,本研究获得的Cry78Ba1蛋白为稻飞虱高效、绿色防控方面创造了有利条件。