茶叶是世界三大无酒精饮料之一,广泛受到消费者的青睐。茶树具有聚氟特性,成熟叶片是其累积氟的主要器官,长期大量饮用由较老叶片加工而成的一些茶类(如砖茶)可能导致人体对氟的过量吸收,对人体健康造成潜在风险,研究茶树富集氟过程的相关机制能够为从根本上解决饮茶氟安全的问题提供理论基础。前期研究表明,细胞壁是茶树叶片结合氟的主要部位,因此,将氟螯合在茶叶细胞壁中是茶树叶片累积氟的重要方式,但其富集氟的具体机制目前尚不清楚。本研究对茶树幼苗进行不同浓度氟处理,进一步分析茶树叶片代谢谱、果胶合成代谢通路,钙调控细胞壁结构组成与氟富集的关系,以期为调控茶树中的氟含量水平提供一定的理论参考。主要研究内容及结果如下:1、外源氟显著影响茶树叶片糖代谢。茶树响应氟胁迫的代谢组学研究表明,氟对茶树叶片代谢产生显著影响。通过对不同氟处理GC-TOF-MS的数据进行单变量和多元变量统计分析,鉴定出苹果酸、半乳糖醛酸、葡糖二酸、果糖、山梨糖、麦芽糖、乳糖、肌醇、二氢槲皮素等差异代谢物质;通过通路分析,鉴定出半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、TCA循环、果胶生物合成等关键代谢通路。氟显著促进果胶合成。进一步对茶叶果胶合成代谢通路进行深入分析,发现氟能诱导果胶合成前体物质相对含量的降低,果胶含量的升高以及果胶合成途径关键酶(GAUT、GAE和GALAK)活性的升高和基因表达的上调,说明氟对茶叶细胞壁果胶生物合成代谢具有促进作用。2、茶树叶片细胞壁果胶结合氟是其累积氟的重要途径。氟的亚细胞分布实验结果显示67%-92%的叶片氟分布在细胞壁中,其中56%-71%的细胞壁氟分布在果胶组分中,半纤维素组分和纤维素组分的细胞壁氟占比分别为20%-28%和8%-15%,说明果胶是茶树叶片结合氟的主要部位。果胶氟占比随外源氟浓度的升高而增加,说明果胶结合氟是茶树叶片累积氟的重要途径。3、茶树叶片细胞壁结构组成变化与其富集氟密切相关茶树叶片细胞壁金属离子含量与其富集氟密切相关。氟能显著诱导茶叶细胞壁中Cu、Mg、Zn、Al、Ca、Ba、B含量的增加,且在不同氟处理下,细胞壁氟含量与Cu、Mg、Zn含量的变化呈现显著的正相关性,说明茶树叶片细胞壁富集氟与其结合Cu、Mg、Zn等金属离子和B离子密切相关。果胶结构与其结合氟的能力密切相关。氟显著诱导茶树叶片细胞壁总物质含量,总果胶含量和纤维素含量水平的增加,然而,对茶叶细胞壁木葡聚糖和RGI类型果胶含量具有抑制作用。FT-IR分析结果表明氟引起茶叶细胞壁酯化羧基官能团数量的减少和离子化状态羧基官能团数量的增加,免疫组化染色实验结果发现氟能诱导低甲基脂化结构果胶荧光强度的增加和高甲基酯化结构果胶荧光强度的降低,这两个结果共同说明氟对茶叶果胶的去甲基酯化进程具有促进作用。氟诱导的茶叶细胞壁果胶含量和果胶去甲基酯化作用的增加会引起细胞壁中自由羧基数量的增加,从而为细胞壁金属离子提供更多的结合位点。推测氟可能通过与果胶和金属离子共同形成某种复合物从而被螯合在细胞壁中。4、外源钙调控茶树氟富集与茶树生理状态和细胞壁结构组成变化相关。适当的外源钙浓度(0.5和5 mmol/L)能够保护茶树免受氟伤害,而在缺钙(0.01和0.05 mmol/L)或钙过量(10 mmol/L)的条件下,茶树对外源氟的累积明显增加,且受到钙和氟的双重胁迫,说明极端钙浓度均能诱导茶树对氟的过量吸收。钙能显著降低茶树叶片细胞壁对外源氟的累积。其中,高钙处理还能引起细胞壁氟占叶片氟比例的下降。对细胞壁各组分的氟含量分析表明钙能抑制细胞壁果胶和半纤维素组分对外源氟的吸附,促进纤维素组分的氟累积,且引起细胞壁氟在果胶和半纤维素组分中分配的降低。这些结果说明钙主要通过调控茶树叶片细胞壁果胶和半纤维素中的氟含量水平从而影响其对外源氟的累积。外源钙通过调控细胞壁金属离子调控其氟的累积。不同钙处理茶叶细胞壁或其果胶、半纤维素组分中的氟含量与细胞壁Al、Mg、Cu、Zn、Mn、K和B元素含量的变化呈显著正相关,这与本研究中不同氟处理实验的结果一致,进一步说明茶叶细胞壁富集氟与累积金属离子和B离子密切相关。外源钙通过调控细胞壁果胶结构影响其对氟的累积。钙诱导的细胞壁含量和木葡聚糖含量的变化与氟含量呈显著正相关性。尽管在不同钙浓度处理下茶树叶片细胞壁果胶含量与氟含量呈现出相反的变化趋势,对果胶结构的免疫组化分析显示钙主要诱导高酯果胶含量的增加,而引起LM19标记的低脂果胶含量的降低,即钙能够抑制茶叶细胞壁果胶的去甲基酯化作用,这将减少细胞壁的金属离子结合位点,从而导致细胞壁金属离子含量水平的降低。以上结果表明,钙抑制茶叶细胞壁富集氟与细胞壁含量和木葡聚糖含量的降低,果胶酯化程度的增加和金属离子含量的降低密切相关。钙可能通过影响茶叶细胞壁果胶的甲基酯化结构从而减少细胞壁对金属离子的累积结,进而引起细胞壁螯合氟离子能力的下降。