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香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是矮缩病毒科(Nanaviridae)香蕉束顶病毒属(Babuvirus)成员,其基因组由6个大小约1kb的环状ssDNA组成,有的株系含有1-3个不同数量的卫星组分。BBTV基因组中各组分除含有同源性很高的调控区外,几乎每个组分含有1个开放阅读框架(ORF)。BBTV各组分编码不同的蛋白,行使不同的功能,其中DNA1编码Rep蛋白,卫星组分(S2、S4)编码复制相关蛋白(RepA)。研究表明,DNA1编码的Rep蛋白和卫星组分编码的RepA蛋白在病毒基因组滚环复制中起作用,在其颈环结构区域进行剪切和连接,产生病毒基因组的各个环状单链组分。已有研究发现DNA1编码的Rep蛋白能够对DNA1、DNA3、DNA5进行剪切和连接:卫星组分(S2、S4)编码的RepA蛋白能够对自身组分起作用,进行剪切和连接,产生卫星组分。但是Rep和RepA对DNA2、DNA4、DNA6等其他组份的复制也还不是很清楚。目前针对BBTV各组分基因编码的蛋白作用尚不明确,其致病机理,与寄主间的相互作用等相关研究也不清楚。为了进一步研究BBTV侵染复制机理及深入了解病毒基因组功能,本研究以具有代表性的BBTV海南分离物(B2)为材料,在完成全基因组测序基础上,用高保真酶一步法获得了 BBTV DNA1～DNA6和卫星组分(S2、S4)原基因组1.1～1.4倍的多拷贝序列。将各组分的多拷贝序列分别插入pMD-19T载体,转化DH5 α感受态细胞并在AMPr抗性的LB平板上生长,菌液PCR筛选阳性克隆,经测序分析和酶切验证等生物分子学方法验证后获得了 BBTV各组分的克隆载体。各组分的克隆载体和植物双向表达载体pCAMBIA3300用HindⅢ和XmaI双酶切并回收,将酶切回收的各组分分别与酶切回收的pCAMBIA3300连接,转化并转化DH5 α感受态细胞并在AMpr和Rif抗性的LB平板上生长,菌液PCR筛选阳性克隆,经测序分析和酶切验证等生物分子学方法验证后获得了 BBTV侵染性克隆系列载体。为了解Rep和RepA在BBTV的复制中所起的不同作用及其分子机制,利用本研究构建的BBTV的侵染性克隆载体,利用农杆菌介导侵染烟草等方法来研究Rep和RepA对病毒基因组的复制调控机制。将各组分单独侵染烟草和将DNA1混匀后侵染烟草,含有DNA1侵染性克隆载体的农杆菌侵染烟草能够检测到DNA1,含有DNA2～DNA6侵染性克隆载体的农杆菌分别与含有DNA1侵染性克隆载体的农杆菌侵染烟草均能检测到各自组分的存在。结果表明,Rep蛋白不仅能参与BBTV DNA1,DNA3,DNA5进行剪接和连接,还能对BBTVDNA2,DNA4,DNA6组分进行剪接和连接;将卫星组分单独侵染烟草结果表明RepA蛋白能够对自身组分起作用,进行剪切和连接,产生卫星组分;将含有卫星组分(S2、S4)侵染性克隆载体的农杆菌侵染烟草,能检测到卫星组分;卫星组分和其余组分一起混合侵染烟草未能检测到其他组分的存在,表明RepA蛋白只能够对自身组分起作用,不能对DNA2～DNA6组分进行剪切和连接。