自噬(autophagy)是一种保守的细胞内物质(蛋白质、细胞器等)降解通路,在动物病毒和植物DNA病毒侵染过程中通常具有防御功能,与此同时,许多动物病毒也进化出一些逃避降解或者干扰自噬活性的反防御策略以利于病毒自身的侵染。植物RNA病毒是否也存在类似的干扰自噬的反防御策略目前尚不明确。活性氧(reactive oxygen species,ROS)的迸发通常会抑制病原物的入侵,但其与病毒侵染之间的关系尚不十分清楚。大麦条纹花叶病毒(Barleystripemosaicvirus,BSMV)是一种ss(+)RNA病毒,它编码的γb蛋白在病毒侵染过程中有多种重要的功能。因此,本研究拟在确认Yb与寄主蛋白(ATG7和GOX)直接互作的基础上,阐明γb蛋白通过抑制自噬途径和活性氧迸发促进BSMV侵染的分子机制,明确γb蛋白的更多未知新功能。根据BSMV侵染的本生烟(Nicotiana benthamiana)中自噬相关基因的转录水平和自噬小泡的数量均显著降低、而自噬流指示蛋白(NBR1)的积累量却显著上升等实验结果,首次发现植物RNA病毒(BSMV)的侵染抑制了自噬的发生,γb蛋白是BSMV抑制自噬的关键因子,其抑制自噬和抑制RNA沉默的功能是相互独立的。γb与自噬通路的关键蛋白ATG7在体内和体外均可直接互作,其中γb蛋白的Y29是互作的关键氨基酸。通过体内Co-IP、体外竞争性pull-down实验和对ATG8/ATG8-PE的检测,证明γb-ATG7的互作比ATG8-ATG7更强。因此,当BSMV侵染时,γb竞争性地干扰了 ATG7和ATG8的相互作用并影响了 ATG8与PE分子的结合,γb是通过抑制自噬来促进BSMV的侵染。沉默ATG5和ATG7基因可增加BSMV的积累并加重症状、瞬时表达的ATG7蛋白抑制病毒侵染,这些结果证明自噬在BSMV的侵染过程中同样具有抗病毒作用。不与ATG7互作的γbY29A突变体丧失了抑制自噬的功能,突变体病毒BSMVY29A的症状减弱、病毒积累量降低,表明在植物防御和病毒反防御的军备竞赛中ATG7是新发现的一个病原物效应子的靶标。利用DAB和NBT染色的方法分别对叶片中过氧化氢(H202)和超氧化物(O2-)进行检测,首次发现BSMV侵染本生烟时抑制了 ROS的迸发,通过瞬时表达BSMV不同蛋白,证明γb蛋白是抑制ROS的关键因子。利用双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down和分子筛凝胶过滤等方法,证明过氧化物酶体乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)与γb在体内和体外直接互作。酶活检测结果显示,γb蛋白在体内和体外均能抑制GOX的酶活,进而破坏了过氧化物酶体的氧化还原状态,抑制了过氧化物酶体中ROS的迸发。沉默GOX基因会导致寄主的ROS代谢发生紊乱,BSMV的侵染也会受到明显的抑制。当BSMV侵染时,γb蛋白通过与GOX的互作直接抑制GOX的酶活,调控过氧化物酶体中产生的ROS到适宜的水平,既促进病毒侵染又维持受侵染植株能正常生长。综上所述,γb蛋白抑制细胞自噬和活性氧迸发以促进BSMV病毒侵染,该现象的发现及其分子机制的阐明,为深入理解病毒的侵染机制、及多功能γb蛋白在寄主防御和病毒反防御的博弈过程中的新功能提供了新的科学证据。