背景与目的地中海贫血(thalassemia,简称：地贫)是一组全球最常见、对人类健康影响最大的常染色体单基因隐性遗传病之一。发病原因是珠蛋白基因的缺陷导致血红蛋白(hemoglobin,Hb)四聚体中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或缺乏(即不能合成),而引起血红蛋白的组成成分比例失衡,进而导致血红蛋白不稳定、红细胞破坏,表现为临床症状轻重不等的慢性进行性溶血性贫血。地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型,其中以α-和β-地中海贫血较为常见。地中海贫血的发生遍布人类生活的地方,亚洲、大洋洲、欧洲、非洲和美洲等五大洲都有地贫的发生,其中热带和亚热带的发生率较高。东南亚是地贫发生率最高的地区之一。我国长江以南的广大地域为该病的高发区,其中尤以广西和广东两省(区)最为显著。据统计我国南方人群中α-地中海贫血基因携带率约为10%,p地中海贫血致病基因携带率为2.8%。α-地中海贫血(a-thalassemia,简称：α-地贫)是由于α-珠蛋白基因的缺失或者突变导致α-珠蛋白肽链合成受到抑制而引起的溶血性贫血,是世界上最常见且发病率最高的一种单基因遗传。α-地贫分为缺失型α-地贫和非缺失型a-地贫两大类。虽然α-地中海贫血主要是由于基因缺失而引起的；但非缺失型突变在Hb H的基因缺陷中占较大比例。而且非缺失型Hb H病人的大多都表现出更严重的a-链合成减少,Hb含量更低而Hb H的量更高,因此临床表现也更为严重,此类患者多数具有输血依赖性；而后者临床表现相对较轻,也极少需要依靠常规输血维持生命。此外非缺失型α-地贫与α-地贫1双重杂合还可导致Hb H胎儿水肿综合症。目前对α-地贫尚无理想的治疗方法,应用DNA分析技术通过大人群筛查和对高风险夫妇采取早期产前诊断和选择性终止妊娠以防重症胎儿出生,是国际上公认的首选办法,有着重要的优生学意义。随着分子生物学的技术的发展,大量的新技术新方法应用于地贫的突变检测。DNA测序技术因具有极高的准确性被誉为突变检测的“金标准”,但是该方法需要昂贵的仪器设备、成本较高,而且实验操作步骤较多,所以不适合临床和大规模筛查。除DNA测序技术外,还有许多方法应用与地中海贫血的突变检测。其中一类是根据DNA突变的发生引起DNA单链的构象变化或影响DNA双链的稳定性的原理对突变进行检测,如单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、温度梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE)。但以上的方法均是基于凝胶电泳进行分析,不利于临床的应用。高效液相色谱(Denatured High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)同样是基于突变引起DNA双链热稳定性改变的原理发展的一种快速,精确,自动化的突变检测方法,但该方法通量比较低,一次进样只能检测一种突变,所以不适合用于大规模筛查。基因芯片(Gene Chip)作为一种先进的、大规模、高通量检测技术,应用于突变的检测；然而该技术成本较高,假阳性率高,目前仍没有广泛应用到地中海贫血的临床诊断。另外,同样基于DNA杂交原理的突变检测方法有寡核苷酸探针杂交法(Allele-Specific Oligonucleotide probe, ASO)和反向点杂交法(Reverse Dot Blot, RDB),其中RDB法相比ASO法更简便易行,而且信号特异性强,技术要求低,仪器设备投入小,更符合中国目前的国情,是目前我国应用最广泛的技术。目前RDB技术整个杂交过程的操作步骤比较多,操作时间也相对较长,成为大规模推广应用的阻力。连接酶检测反应(Ligase Detection Reaction, LDR)是一种新兴的突变检测技术。其工作的原理是利用DNA连接酶具有极强的突变识别能力,上游探针和下游探针跟目标杂交时,只有当探针与目标完全互补是才能被连接；如果在上游引物的3’端或下游引物的5’端发生碱基错配都会使连接反应不能进行,从而不能形成连接产物。由于LDR反应使用的是具有热稳定性的DNA连接酶,可以进行热循环反应,连接产物呈线性增长,具有一定的信号放大效果。LDR的另一个优势是多重性：由于连接反应具有很强的特异性,所以允许同一个反应中加入多组针对不同突变位点的探针,其探针之间的干扰非常小,能够同时对多个突变进行检测。目前,LDR技术结合PCR技术(PCR/LDR)广泛应用于突变研究和临床的突变检测。该方法结合了PCR技术的高灵敏性和LDR技术的高特异性；首先通过PCR反应对目标序列进行扩增,然后通过LDR反应对突变进行区分。在LDR引物上标记荧光基团,使LDR反应的产物能够使用荧光检测系统进行分析。目前常用的检测方法有毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis, CE)和芯片法(Chip Assay)。其中,毛细管电泳分析是通过不同突变类型产生的连接产物片段长度的不同进行突变区分的。但由于毛细管电泳法通量较低,而且一起设备昂贵,所以其应用没有芯片法广泛。芯片法具有高通量的优势,而且LDR技术结合芯片分析与传统芯片结果比较：结果唯一确定,非此即彼；没有假阳性假阴性结果；操作简单,结果稳定,可重复性强。但是,芯片分析的需要把连接产物与未连接的引物分离,洗脱步骤比较费时,不利于快速检测。基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)原理的探针用于LDR反应产物的检测可以免除对未连接引物的清除。只有当连接反应发生,两个荧光基团靠近才能发生荧光共振能量转移,产生可检测的荧光信号,而未连接的引物不能发出荧光信号,从而不需要进行连接产物与引物分离。分子信标(Molecular Beacon, MB)是其中一种基于基于荧光共振能量转移原理设计的分子探针。分子信标由于具有高灵敏度和高特异性等优势,广泛应用于医学和生物学研究中。由于PCR/LDR分析方法提供了一种新的点突变检测策略,本研究目的在于建立一种准确性高,高灵敏,快速的基于PCR/LDR法的点突变检测方法,用于地中海贫血已知点突变的检测。设计与方法本方法的设计理念：本方法设计一种全新的信号转换方式,利用分子信标自身的热稳定性,利用一系列具有不同Tm值stem端得分子信标作为信号转换器,把目标的突变信号转换为温度信号,通过溶解曲线分析来对突变进行分析。PCR/LDR/熔解曲线分析检测突变的实验流程如下：第一步,对目标序列进行PCR扩增,产生大量的扩增子作为LDR反应的模板。第二步,进行LDR反应,当突变存在时,上游引物和下游引物与模板完全互补,在Taq DNA连接酶的作用下连接在一起；由于Taq DNA连接酶具有耐热性,可以进行热循环。第三步,连接产物在高温淬火后形成分子信标结构,由于荧光基团和淬灭基团紧紧靠近,荧光被淬灭。第四步,进行熔解曲线分析,随着温度升高,分子信标打开荧光逐渐增强。第五步,通过软件分析得出分子信标的Tm值,通过不同的Tm值判断突变的类型。本研究的方法如下：1.实验模型：本研究采用α-地中海贫血的三种常见点突变(Hb WS、HbQS、HbCS)作为模型构建PCR/LDR/熔解曲线分析方法。2.LDR引物的设计：针对3个位点设计3对LDR引物,每一对引物包括上游引物和下游引物。上游引物的5’端标记荧光基团(HEX)而3’端为识别碱基(该序列于突变序列完全互补)；下游引物的3’端标记淬灭基团(BHQ1),5’为磷酸化修饰。除了与目标互补的序列外,上游引物的5’和下游引物的3’端为一段互补的stem结构。上下游引物组成的分子信标的结构用Zucker实验室的DNA折叠软件进行评价和预测。3.用人工合成的目标进行LDR/熔解曲线分析方法的构建并评价Taq DNA连接酶的特异性。4.针对α2基因设计PCR引物并扩增包含3种突变类型的片段；PCR产物用于单重和多重PCR/LDR/熔解曲线分析的建立和条件优化,并对该方法的灵敏度进行评价。5.实验数据用SPSS软件进行统计学分析。结果与讨论用人工合成目标作为模板的模拟实验证明了该方法是可行的。当用突变目标作为模板时熔解曲线分析结果得出一个峰尖朝下的熔链峰；而用野生目标作模板或没有模板的情况下不出现熔链峰。Taq DNA连接酶具有很强的突变识别能力,特异性很高。Taq DNA连接酶能在不同的buffer下工作。针对3个突变位点的合成目标分析结果得到的各位点分子信标Tm值于预测的温度有一定的差异,但属于温度平行增加,各实测温度与预测温度的差值(△Tm)接近。用PCR产物进行单重和多重LDR/熔解曲线分析得出的各分子信标的Tm值与模拟实验的相符,由于buffer中离子浓度和pH值的不同,温度有一定的偏差。多重反应的结果说明该方法具有高通量检测的潜力。灵敏度分析结果显示,该方法可以检测到100pg人类基因组DNA模板,具有较高的灵敏度。结论本研究提出的PCR/LDR/熔解曲线分析方法是一种快速,准确的点突变检测技术。现阶段仅对3个位点进行多重反应,由于LDR反应具有很好的多重反应性,加上采用不同的荧光信号,检测通量将会大大的提高,所以该方法的具有高通量检测的潜力,适合多种突变的同时检测。但该方法也存在一些缺点,如不能对杂合突变和纯和突变进行区分,不适合用于临床诊断。所以本方法应定位在于对表型正常的携带者进行突变检测,还可以在大规模人群筛查中作为初步筛查的工具。